不同单色光对紫色红曲霉生长、色素和桔霉素合成的影响

刘 宏，陈 迪，2，陈勉华，李贞景，王昌禄,*

(1.天津科技大学 食品工程与生物技术学院/省部共建食品营养与安全国家重点实验室/食品营养与安全教育部重点实验室， 天津 300457；2.河南工业大学 生物工程学院， 河南 郑州 450001)

红曲霉可以产生大量具有生物活性物质的次级代谢产物[1-3]。红曲色素作为红曲霉的主要次级代谢产物，具有多种生物活性[4-12]。人们已完成了6种主要红曲色素的结构鉴定，包括两种红色素：红斑红曲胺(rubropunctamine，RUM)、红曲玉红胺(monascorubramine，MOM)；两种黄色素：红曲素(monascin，MS)、红曲黄素(ankaflavin，AK)；两种橙色素：红斑红曲素(rubropunctatin，RUN)、红曲玉红素(monascorubrin，MON)[3]。真菌肾脏毒素——桔霉素的发现引起了人们对于红曲霉安全性的争论，限制了红曲产品的开发和应用[13]；因此，在提高红曲色素产量的同时降低桔霉素产量，对红曲产品开发和应用具有重要意义。

光作为一种重要信号，可用来调控丝状真菌的生长、发育及次生代谢。不同波长的单色光对丝状真菌的生长发育及次级代谢的影响各不相同[14]。大量研究[15-18]表明，不同光源对红曲霉色素和桔霉素的产生有很大影响，但研究还不够深入。目前，系统研究不同光源对红曲霉生长及色素产生的报道并不多见，研究红光不同光照条件对红曲色素和桔霉素产生的影响也鲜有报道。本文拟对不同波长单色光特别是红光对紫色红曲霉(Monascuspurpureus)M9生长、色素和桔霉素产量的影响进行研究，并从分子水平上初步探讨光照培养对红曲色素和桔霉素代谢机理的影响，希望为光照发酵法高产红曲色素、低产桔霉素提供技术支撑，为红曲霉次生代谢途径研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌种来源

红曲霉菌株(MonascuspurpureusM9)，由天津科技大学食品工程与生物技术学院发酵食品与生物资源开发研究室保藏。

1.1.2主要试剂

葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4，天津市化学试剂一厂；无水乙醇，天津市江天化工技术有限公司；琼脂粉，北京索莱宝生物科技公司，以上试剂均为国产分析纯。乙腈、甲酸(国产色谱纯试剂)，上海安谱科学仪器有限公司；GoldviewI型核酸染色剂、6×DNA Loading Buffer、1kb plus DNA Ladder(国产生化试剂)，北京索莱宝生物科技公司；DM2000 Marker(国产生化试剂)，康维世纪生物科技有限公司；Plant RNA Kit，美国Omega Bio-Tek公司；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，康维世纪生物科技有限公司；SYBR® Premix Ex TaqTM II，Takara(大连)有限公司。

1.1.3主要培养基

麦芽汁琼脂培养基(MEA)：将麦芽磨碎，加入4倍体积水，60 ℃水浴至麦芽糖度为18～20°BX，8层纱布过滤，置于-20 ℃冰箱备用。使用时融化麦芽汁，将糖度调为10～12°BX，加入质量分数为3%琼脂，121 ℃灭菌20 min。

种子液培养基：葡萄糖6 g，蛋白胨 2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，自来水100 mL，乳酸调pH值至5.5左右，121 ℃灭菌20 min。

液体发酵培养基：大米粉5 g，NaNO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO40.15 g，自来水100 mL，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。

固体平板培养基：麦芽糖4 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨 3 g，琼脂3 g，自来水100 mL，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD型超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；LRH-250-GII型微电脑控制光照培养箱，广东省医疗器械厂；J-26XP型高速冷冻离心机，贝克曼库尔特(中国)有限公司；1200型高效液相色谱仪、MX3000P型实时荧光定量PCR仪，美国安捷伦科技有限公司；KW-T8ZW-12W型LED单色灯(红光、黄光、绿光和蓝光)，深圳宸华照明有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1菌株保藏和种子液制备

用无菌接种环挑取紫色红曲霉M9菌丝，划线于麦芽汁斜面培养基上，30 ℃培养7～9 d，将活化好的菌种保藏于4 ℃冰箱，一个月活化一次。

向紫色红曲霉M9试管斜面加入5 mL生理盐水，用无菌孢子铲轻轻刮取孢子，制成孢子悬液。将孢子悬液全部倒入种子培养基中，在30 ℃，180 r/min的摇床中培养36～40 h，制成种子液。

1.3.2菌落形态观察

将制备好的种子液过8层无菌纱布，得到孢子悬液，通过血球计数板将孢子浓度调为106个/mL。取20 μL孢子悬液，单点法加在固体平板培养基中心，待菌液被培养基充分吸收后转入装有LED单色灯(红光、黄光、绿光和蓝光)的恒温培养箱中。调整光照强度为100 lx，光照组置于光源的正下方，黑暗组避光培养，30 ℃静置培养10 d，分别在第4、7、10天记录菌落形态。

1.3.3液态发酵方法和光照条件

将制备好的种子液过8层无菌纱布，得到孢子悬液，调孢子浓度为106个/mL。将5 mL孢子悬液接种于50 mL的大米液态发酵培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中，静置培养10 d。

光照实验分为两组。第一组将恒温培养箱划分为5个独立灯室，每个灯室安装不同波长的LED单色光(红光、黄光、绿光和蓝光)。光照强度调整为100 lx，光照时间为持续光照，避光室为黑暗培养。第二组将恒温培养箱划分为5个独立灯室，每个灯室安装红色LED单色光，分别在不同光照时间15、30、45、60 min/d，不同光照强度100、200、300、400 lx下培养，避光室为黑暗培养。

1.3.4红曲色素和桔霉素的提取方法

将发酵结束后的红曲霉菌丝体烘干至恒重，用研钵将其磨成粉末状，过80目筛。准确称取0.500 0 g红曲粉末样品，装入10 mL离心管中，加入4 mL 75%乙醇，振荡混匀，超声30 min，3 500 r/min离心10 min，收集上清液于10 mL容量瓶中。向沉淀物中加入3 mL 75%乙醇，混匀，超声30 min，3 500 r/min离心10 min，收集上清液。再重复此操作一次，将3次上清液合并，用75%乙醇定容至10 mL。稀释10倍后，用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤，高效液相色谱(HPLC)法进行分析。

1.3.5红曲色素和桔霉素的HPLC检测

1.3.5.1 红曲色素的测定

色谱柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相：A泵(水+0.1%甲酸)，B泵(乙腈)。乙腈和水分别过0.45 μm的有机系滤膜和水系滤膜，脱气30 min。检测器：DAD(二极管阵列检测器)，流速为1 mL/min，检测波长为410 nm，检测温度为25 ℃，进样量为20 μL。

梯度洗脱方法如表1。

表1 HPLC梯度洗脱流动相比例

1.3.5.2 桔霉素的测定

色谱柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相：A泵(水，色谱纯甲酸调pH值为2.5)，B泵(乙腈)。乙腈和水分别过0.45 μm的有机系滤膜和水系滤膜，脱气30 min。检测器为荧光检测器，流速为1 mL/min，检测波长为激发波长(λex)331 nm，发射波长(λem)500 nm，检测温度为25 ℃，进样量为20 μL。桔霉素检测采用等度洗脱，流动相中水与乙腈的比例为55%：45%。

1.3.6红曲色素和桔霉素合成相关基因表达量的测定方法

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)报道的红曲霉色素和桔霉素合成相关基因序列为参考序列。与红曲霉色素合成相关的基因有MpPKS5、mppR1、mppA、mppB、mppC、mppD、mppE、mppR2、MpFasA2、MpFasB2、mppF(Gen Bank accession no. KC148521)，与红曲霉桔霉素合成相关的基因有orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5 (Gen Bank accession no. AB243687)、pksCT(Gen Bank accession no. AB167465)、ctnD、ctnE、ctnF、ctnG、ctnH、ctnI、ctnR(Gen Bank accession no. EU309474)。用NCBI上的Primer-BLAST软件设计引物，以β-actin基因作为内参基因。

使用Omega厂家生产的Plant RNA Kit提取红曲霉总RNA，用HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA，采用SYBR Green染色实时荧光定量PCR方法对红曲色素与桔霉素合成相关基因相对表达量进行监控。扩增曲线条件：95 ℃，30 s，1 Cycle；95 ℃，变性5 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃，延伸30 s，42 Cycles。溶解曲线条件：95 ℃，15 s，60 ℃，退火30 s，最后，产物在95 ℃延伸15 s，同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析。采用β-actin基因作为内参基因。

1.3.7数据统计分析

使用SPSS17.0软件，对实验数据进行方差分析；用Origin9.0软件绘图。每个实验做3个平行实验，结果以平均值±标准差表示。P<0.05(*)，P<0.01(**)。

2 结果与讨论

2.1 不同单色光对紫色红曲霉M9菌落形态的影响

A：持续黑暗；B：持续红光；C：持续黄光；D：持续绿光；E：持续蓝光。从左往右依次为培养第4、7、10天。图1 持续光照对紫色红曲霉M9菌落形态的影响Fig.1 Effects of continuous light exposure on colony morphology of Monascus purpureus M9

以黑暗培养条件作为对照，研究不同单色光在持续光照下对紫色红曲霉M9菌落形态的影响，结果如图1。由图1可知，相比黑暗条件下，当在持续红光照射时，第4天时出现很明显的辐射状褶皱；随着培养时间的增加，辐射状褶皱逐渐增多，在第10天时出现显著的暗红色区域，菌丝更长、更稠密且颜色更深。在持续蓝光照射下，菌丝颜色为白色，极为稀疏，无辐射状褶皱出现。在持续黄光和绿光照射下，菌丝颜色稍浅且无明显辐射状褶皱和暗红色区域出现。结合前期研究成果[19]及本研究可以看出：相比黑暗条件，在持续光照下，红光可以显著促进紫色红曲霉M9菌丝生长及菌丝内色素的合成；蓝光显著抑制了菌丝的生长及菌丝内色素的合成；黄光和绿光对菌丝生长及菌丝内色素的产生有些抑制作用。

2.2 不同单色光对紫色红曲霉M9红曲色素产量的影响

*，P<0.05; **,P<0.01。图2 持续光照对紫色红曲霉M9 6种红曲色素产量的影响Fig.2 Effects of continuous light exposure on six monascus pigments production of Monascus purpureus M9

以黑暗培养条件作为对照，研究不同单色光在持续光照下对紫色红曲霉M9产生6种色素产量的影响，结果如图2。由图2可以看出，相比黑暗条件，在持续红光照射时，6种红曲色素产量都有增加，两种红色素RUM、MOM的产量分别增加了7.86%、17.33%；两种黄色素MS、AK产量分别增加了11.14%、15.61%；两种橙色素RUN、MON的产量分别增加了11.47%、16.69%。在持续黄光照射时，6种色素的产量分别降低了8.28%、24.46%、9.64%、6.57%、10.21%、15.6%；在持续绿光照射时，6种色素产量分别降低了8.41%、30.62%、11.43%、8.34%、33.56%、57.71%；而在持续蓝光照射时，6种色素产量降低得更为显著，分别降低了47.43%、36.75%、48.22%、52.31%、73.84%、60.71%。由此可知，持续红光照射增加了紫色红曲霉M9 6种色素的产量，而持续黄光、绿光、蓝光照射都减少了紫色红曲霉M9 6种色素的产量。

不同单色光对紫色红曲霉M9菌落形态及色素产量影响结果表明，红光是最显著促进红曲霉生长以及色素产生的光源。据文献报道，不同光照时间和光照强度是影响红曲色素产生的主要因素[11]，因此，后续实验中，主要研究不同红光照射条件对红曲色素和桔霉素产量及相关基因表达量的影响。

2.3 红光不同光照时间对紫色红曲霉M9色素及桔霉素产量的影响

图3 红光不同光照时间对紫色红曲霉M9色素和桔霉素产量的影响Fig.3 Effects of red light with various illumination time on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

以黑暗培养条件作为对照，研究红光不同光照时间对紫色红曲霉M9色素及桔霉素产量的影响，结果如图3。由图3可知，随着红光光照时间的增加，两种红色素RUM、MOM和两种黄色素MS、AK产量都呈现先增加后减少的趋势，而两种橙色素RUN、MON产量呈现先减少后增加的趋势；桔霉素产量的变化趋势与橙色素相似。相比黑暗条件下，在红光不同光照时间下，两种红色素和两种黄色素的产量都有显著增加，而两种橙色素及桔霉素的产量却显著降低。由此分析可知，相比黑暗条件，红光不同光照时间可以促进RUM和MOM以及MS和AK的产生而抑制RUN和MON的产生，同时也抑制了桔霉素的产生。当红光光照时间为30 min/d时，RUM和MOM产量分别增加了36.01% 和 55.72%，MS 和 AK产量分别增加了29.67% 和 37.92%，RUN和MON产量分别降低了27.83% 和 29.42%；桔霉素产量降低了25.39%。本研究表明，红光照射30 min/d为最佳的高产红曲色素低产桔霉素的光照时间。

2.4 红光不同光照强度对紫色红曲霉M9色素及桔霉素产量的影响

图4 红光不同光照强度对紫色红曲霉M9色素和桔霉素产量的影响Fig.4 Effects of red light with various illumination intensities on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

*，P<0.05; **,P<0.01。图5 红光不同光照条件对紫色红曲霉M9红曲色素和桔霉素合成相关基因表达量的影响Fig.5 Effects of red light with different illumination conditions on expressions of monascus pigments and citrinin biosynthetic genes of Monascus purpureus M9

以黑暗培养条件作为对照，研究红光不同光照强度对紫色红曲霉M9色素及桔霉素产量的影响，结果如图4。由图4可知，随着红光光照强度的增加，两种红色素RUM、MOM和两种黄色素MS、AK的产量都呈现先增加后减少的趋势，而两种橙色素RUN、MON产量呈现先减少后增加的趋势；桔霉素产量的变化趋势与橙色素相似。相比黑暗条件下，在红光不同光照强度下，两种红色素和两种黄色素的产量都显著增加，而两种橙色素和桔霉素的产量显著降低。由此分析可知，相比黑暗条件下，红光不同的光照强度可促进RUM和MOM及MS和AK的产生，抑制RUN和MON的产生，对桔霉素的产生也有抑制作用。当红光光照强度为300 lx时，RUM和MOM产量分别增加了54.32%和71.51%，MS和AK产量分别增加了42.28%和59.72%，RUN和MON产量分别降低了41.94%和54.63%；桔霉素产量降低了40.19%。本研究表明，红光300 lx光照强度为最佳的高产红曲色素低产桔霉素的光照强度。

2.5 红光不同光照条件对红曲色素和桔霉素合成相关基因表达量的影响

以黑暗培养条件作为对照，研究红光不同光照条件对红曲色素和桔霉素合成相关基因表达量的影响，结果如图5。由图5(a1)、(a2)和(b1)、(b2)可知，在红光不同光照时间下，红曲色素合成相关基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表达量由高到低依次为黑暗，15、60、45、30 min/d，而mppC、mppE的基因表达量由高到低依次为30、45、60、15 min/d，黑暗；在红光不同光照强度下，红曲色素合成相关基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表达量由高到低依次为黑暗，100、200、400、300 lx，而mppC、mppE的基因表达量由高到低依次为300、400、200、100 lx，黑暗。结合图3和图4，红光不同光照时间和强度对红曲色素产量的影响可推测，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表达量变化趋势与红曲色素中两种橙色素产量的变化趋势呈正相关，mppC、mppE的基因表达量变化趋势与红曲色素中两种红色素和两种黄色素产量的变化趋势呈正相关。由此分析可初步推测，在红光照射条件下，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能参与了橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能参与了红色素和黄色素的生物合成。

由图5(c1)、(c2)和(d1)、(d2)，结合图3和图4，同理可推测出，桔霉素合成相关基因ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT的基因表达量与桔霉素的产量呈正相关，而ctnR1的基因表达量与桔霉素的产量呈负相关。通过分析结果可初步推测，在红光照射条件下，ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能参与了桔霉素的合成代谢，而ctnR1可能参与了桔霉素的分解代谢。

3 结 论

通过研究不同单色光对紫色红曲霉M9菌落形态和6种红曲色素产量的影响及红光不同照射条件对6种红曲色素和桔霉素产量及相关基因表达量的影响，可得出结论：1)相比黑暗条件，在持续光照下，红光是最显著的促进紫色红曲霉M9菌丝生长及色素产生的光源。2)高产红曲色素低产桔霉素的最佳红光光照时间为30 min/d，最佳光照强度为300 lx。3)初步推测红曲霉M9色素合成相关基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能参与两种橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能参与两种红色素和两种黄色素的生物合成；ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能参与桔霉素的合成代谢，而ctnR1可能参与桔霉素的分解代谢。

今后，可深入研究红光调控紫色红曲霉M9产生红曲色素和桔霉素机理，为光照发酵法提高红曲色素产量、降低桔霉素生成机制提供依据，为进一步研究光照调控其他丝状真菌的次级代谢提供参考。