酶解超声波协同提取藜麦多糖及体外活性评价

李佳妮，白宝清，金晓第，范三红

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

藜麦原产于南美洲安第斯山区的秘鲁、玻利维亚等地，具有抗寒、抗旱、耐贫瘠和耐盐碱等特征[1]，近些年才开始在全球其他地区得到推广和种植，我国目前已经在西藏、山西静乐、四川、青海等地实现规划化种植[2]。藜麦是唯一含优质完全蛋白质的植物性食物[3]，富含不饱和脂肪酸、膳食纤维以及类黄酮、皂苷、叶酸等活性成分，并且矿物质含量丰富，明显高于其他常见谷物[4]。藜麦不含麸质等过敏原[5]，且营养成分容易被吸收。除此之外，藜麦具有均衡营养[6]、抗氧化[7]、抗癌症与减肥[8]等效果，适合于那些患有高血压、高血糖[4]、高血脂等慢性病患者的辅助治疗。藜麦具有很高的食用价值，是目前公认的适宜人类食用的“全营养食品”[9]。

多糖（polysaccharide）作为构成生命的四大基本物质之一，在自然界分布广泛，是动植物的能源物质，也是构成动植物细胞壁的组成成分[10]。具有调节免疫、抗癌、抗氧化、辅助降血糖等功效[11]，所以多糖在保健食品、医药领域有广泛的运用前景[12]。目前多糖提取常用的方法有：常规水提法、酸提取、超声提取、微波提取、酶法等[13]，采用联合方法提取的研究还比较少。袁俊杰等[14]采用水浴加热回流法提取藜麦多糖，提取时间为1.5 h。徐澜等[15]采用单一超声辅助提取藜麦多糖，提取率为2 mg/g。由于酶具有用量少而催化效率高的特点，能够加速多糖的溶出，克服传统提取方法耗时长、产率低的缺陷。本试验基于响应面法，采用超声波与酶法联合方法对藜麦多糖的提取工艺进行了研究，使多糖提取率提高，成本降低，从而为开发利用藜麦多糖提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜藜麦种子：山西华青藜麦产品开发有限公司；纤维素酶（酶活力为3.0×103U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力为6 000 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JA1203N 型电子分析天平：梅特勒－托利仪器上海有限公司；101-2AB 型鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SB-5200DT 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5 离心机：上海安亭科学仪器有限公司；SP-2000UV 型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器厂；RE-52 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 藜麦成分分析

1.3.1.1 藜麦中蛋白含量测定

采用凯氏定氮法测定藜麦中蛋白含量，参考GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

1.3.1.2 藜麦中粗脂肪含量测定

采用索氏抽提法测定藜麦中粗脂肪含量，参考GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》。

1.3.1.3 藜麦中粗多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定藜麦中粗多糖含量，参考SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。

1.3.2 藜麦多糖提取工艺

1.3.2.1 材料预处理

藜麦→挑选、去杂→粉碎→45 目过筛→80 ℃烘干→料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇静置6 h（除去脂类、低聚糖等小分子）→60 ℃烘干→密封，放入干燥器备用。

1.3.2.2 藜麦多糖提取

预处理后的藜麦→按料液比加水配成溶液→调节pH值→加酶，水浴恒温提取1 h →煮沸灭酶10 min →超声波辅助提取（240 W）→离心得上清液（4 000 r/min，15 min）→旋转蒸发浓缩→加3 倍体积95 %乙醇→4 ℃静置过夜→离心（4 000 r/min，15 min）→沉淀溶解定容→测定粗多糖浓度。

1.3.2.3 含量测定

采用苯酚-硫酸法[16]测定多糖含量，以葡萄糖为标准品，得标准曲线y=14.432x+0.017 9，R2=0.995 2。粗多糖溶解定容至100 mL，摇匀后吸取1 mL 稀释至10 倍，于490 nm 波长处测其吸光度值，根据标准曲线计算藜麦多糖浓度。

藜麦多糖提取率Y/%=（C×V×N）/（32.4×W）×100

式中：W为藜麦粉末的质量，g；C为所测液多糖浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；32.4 为本试验藜麦多糖含量测定值，mg/g。

1.3.2.4 最佳辅助酶及其添加量确定

按1.3.2.2 方法，以不加酶做空白对照，分别添加纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶质量比为1：1：1），添加量均为原料质量的3 %，在最适温度（50 ℃），最适pH值（蛋白酶6.8，其他5.0）下水浴恒温提取1 h，比较不同辅助酶下多糖提取率。确定最佳辅助酶，设置添加量梯度，在最适条件下提取，确定最佳添加量。

1.3.2.5 单因素试验

选取超声时间（10、20、30、40、50 min），料液比[1：15、1：25、1：35、1：45、1：55（g/mL）]，超声温度（40、50、60、70、80 ℃）为自变量，以蒸馏水为溶剂，通过控制变量法对藜麦多糖提取条件进行单因素试验，平行测定3 次。分别考察藜麦多糖提取率随3 个单因素变化时的变化趋势。

1.3.2.6 响应面试验

基于单因素试验，根据Box-Behnken 试验设计原理，以超声温度、超声时间及料液比为自变量，多糖提取率为响应值，试验水平高低分别编码-1、0、1，进行三因素三水平响应面试验。响应面试验数据经Design Expert 8.0 软件分析，获得提取藜麦多糖的最佳提取条件。试验因素水平见表1。

表1 试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 脱蛋白工艺

1.3.3.1 蛋白标准曲线绘制

以牛血清蛋白为标品，考马斯亮蓝法测定不同浓度牛血清蛋白的吸光度值，得蛋白标准曲线方程：y=0.143x-0.001，R2=0.993 9。

1.3.3.2 木瓜蛋白酶+Sevage 法脱蛋白

参考苗慧琴等[17]的方法，取适量提取的粗多糖，调节pH值至中性，加入原料质量2 %木瓜蛋白酶，在45 ℃条件下酶解1 h，煮沸灭酶10 min，冷却至室温后4 000 r/min 离心5 min，弃去变性蛋白层得上清液，加入1/3 体积Sevage 试剂（V氯仿：V正丁醇=4：1）剧烈振荡30 min，4 000 r/min 离心15 min，弃去中间变性蛋白层和下层有机溶剂，取上层脱蛋白后的多糖液，重复多次，合并所有已完全脱蛋白的多糖液。

1.3.4 体外活性研究

1.3.4.1 对α-淀粉酶活力的抑制作用

参考GB/T 24401-2009《α-淀粉酶制剂》。

1.3.4.2 羟自由基清除能力测定

取不同梯度浓度的多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亚铁溶液2 mL，充分摇匀，静置10 min，加入6 mmol/L 水杨酸溶液2 mL，摇匀并静置30 min，于510 nm 处测定吸光度Ai，水杨酸溶液以蒸馏水代替测定本底Aj，多糖溶液以蒸馏水代替做空白A0。清除率S/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.3.4.3 DPPH 自由基清除率测定

配制0.2 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液避光保存，取4 mL DPPH 溶液与2 mL 梯度浓度多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）混合均匀，于25 ℃避光反应30 min，517 nm 波长下测定吸光度Ax，以乙醇溶液代替DPPH 自由基测得背景对照Ay，再以蒸馏水代替多糖溶液测得空白对照A0，计算清除率。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率测定

取25 mL 的7 mmol/L ABTS 溶液和440 μL 的140 mmol/L过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置12 h～16 h，配制成ABTS＋自由基储备液[18]。使用时用无水乙醇稀释成工作液，使其在734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02，记为Ar。取0.1 mL 梯度浓度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加入ABTS+自由基工作液5 mL，混均，室温下避光反应10 min，测定734 nm波长处吸光度，记为At。空白以无水乙醇代替ABTS+自由基工作液测吸光度值，记为A0。

2 结果分析

2.1 藜麦主要成分分析结果

藜麦主要成分见表2。

表2 藜麦主要化学成分分析Table 2 Analysis of main chemical constituents of Chenopodium quinoa

2.2 藜麦多糖提取结果分析

2.2.1 最佳辅助酶确定

不同辅助酶下多糖提取率见图1。

图1 不同辅助酶下多糖提取率对比Fig.1 The comparison of polysaccharide yields under different assisted enzymes

添加适量的辅助酶对藜麦多糖提取率有明显提高，纤维素酶和果胶酶使藜麦细胞壁遭到破坏，有助于细胞内的多糖溶出，提高提取率。藜麦中蛋白质含量较高，有的多糖与蛋白质结合在一起，难以提取或干扰测定[19]，蛋白酶的加入使得蛋白质酶解，有效解除蛋白质干扰，提高提取率。图1可直观地看出，纤维素酶对于提高藜麦多糖提取率效果最为明显，与不加酶相比，提取率增加到原来的2.5 倍。本试验选取纤维素酶作为添加酶。

2.2.2 最佳辅助酶添加量

不同纤维素酶添加量下多糖提取率如图2。

图2 藜麦多糖提取率随纤维素酶添加量的变化情况Fig.2 The changing situation of the yield of Chenopodium quinoa changed with the amount of cellulase added

在底物浓度一定的情况下，酶促反应速度正比于酶浓度。因此随着酶初始浓度的增大，酶促反应也加快。但随着酶初始浓度继续增大，酶促反应速度并没有因此加快，甚至受到抑制。其原因是：当酶已经达到饱和状态时，过量的酶聚集在有限的底物上，反而降低了酶的利用率。图2可直观地看出纤维素酶最佳添加量为3%。

2.2.3 单因素试验结果

不同超声温度、超声时间及料液比下多糖提取率见图3。

图3 超声温度、超声时间和料液比对藜麦多糖提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic temperature，ultrasonic time and solidliquid ratio on the extraction rate of Chenopodium quinoa polysaccharide

图3a 表明，多糖提取率随超声温度的而逐渐升高上升，60 ℃左右达到最高，随后又逐渐下降。这是由于升温能够促进多糖溶解，并且提高传质速度。但随着温度的继续升高，高温破坏多糖的结构，反而降低了多糖的浸出率。图3b可观察出，多糖提取率随超声时间延长先升高再下降，在20 min 左右时达到最大。分析原因可能是在一定的变化区间内，随着超声时间延续，会促进藜麦多糖的溶解，然而随着超声时间继续延续，多糖的结构遭到破坏，再综合考虑缩短工时，20 min 为最佳提取时间。图3c可直观地得出，多糖提取率随溶剂用量的增加先逐渐升高后逐渐降低，料液比为1：35（g/mL）左右达到最大。分析可能原因是随着提取溶剂用量的增加，多糖能够充分溶解，随着提取溶剂用量继续增加，反而降低了提取液中可溶性多糖的含量，从而提取率降低。综上，藜麦多糖提取的最佳料液比是1 ∶35（g/mL）。

2.2.4 响应面试验结果

2.2.4.1 Box-Behnken 试验设计及结果

基于单因素试验，综合考虑经济效益，确定各个自变量最佳区间范围，依据Box-Behnken 试验的设计理论，优化藜麦多糖提取工艺，试验设计和结果如表3。

2.2.4.2 模型的建立与显著性检验

经Design Expert 8.0 分析，以藜麦多糖提取率作为响应值，对Box-Behnken 试验设计结果进行分析，得到响应面回归方程如下：

从方程中可得出各变量对响应值交互作用的影响程度依次是：A超声温度＞B超声时间＞C料液比。表4是回归模型的方差分析结果。

表3 Box-Behnken 试验设计及结果Table 3 Box-Behnken design with experimental and predicted results for response surface methodology

表4 回归模型的方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of regression model

从整体上看，模型P值小于0.000 1，表明回归模型显著性极好；失拟项P值为0.900 2，不显著，表明模型与现实情况模拟程度极好[20]；调整复相关指数R2=说明多糖提取率的变化98.37%都来自于超声温度与超声时间以及料液比[21]，即试验的误差小，预测值与实际值间符合情况较好。F值体现各变量对响应值的贡献率，F值越大则自变量对藜麦多糖提取率的影响越大，分析结果与回归方程一致，其中提取率受超声温度的影响远超过其他因素的影响。综上分析，此方案可以用来优化藜麦多糖的提取工艺条件。

从表4分析得出，单因素中，超声温度和超声时间对多糖提取率影响极显著，料液比对多糖提取率作用不显著。在两个因素交互影响中，超声温度和超声时间的交互作用对多糖提取率影响不明显，而超声温度和料液比、超声时间和料液比的交互作用对多糖提取率影响显著。

2.2.4.3 响应面分析

图4～图6 为两因素交互作用对多糖提取率的等高线图和响应面曲图。

图4 超声温度和超声时间Fig.4 Ultrasound temperature and extraction time

图5 超声温度和液料比Fig.5 Ultrasound temperature and solid-liquid ratio

图6 超声时间和液料比Fig.6 Ultrasound time and solid-liquid ratio

等高线图、响应面图可以直观地反映两因素间的交互作用。响应面图越陡说明两自变量的交互作用对响应值影响程度越大，相反，越平缓交互作用影响越不显著。等高线图越偏离圆形交互影响越强，反之，越接近圆形交互影响越弱。分析以上3 组图得出，超声温度和料液比间交互作用对藜麦多糖提取率作用最为明显，其次是超声时间和料液比间的交互作用，而超声温度和超声时间的交互影响最不显著。

从响应面图观察得出，超声温度60 ℃～65 ℃之间、超声时间15 min～20 min 之间时多糖提取率有最大值。对比图5 与图6 得出，藜麦多糖提取率受超声温度的影响比超声时间大；比较图4和图5可以得出多糖提取率受超声时间作用比料液比大；同样，对比图4和6可得料液比对藜麦多糖提取率的作用较超声温度小，与方差分析结果一致。响应面图开口向下，多糖提取率随各自量的升高，不断上升，中心点过后又不断下降，本试验模型具有驻点，且驻点正是最大的值。各响应面变图顶点对应最优提取量。

2.2.4.4 最佳工艺条件验证

为进一步确定最优点，应用响应面分析方法对模型进行回归分析，得到提取藜麦多糖的最佳提取参数是：超声温度64.90 ℃；超声时间18.34 min；料液比1：32.5（g/mL），此时多糖提取率为70.78%。考虑到实际操作的方便，将理论值调整为：超声温度65 ℃；超声时间18 min；料液比1：33（g/mL）。在此基础上平行验证3 次，测得藜麦多糖平均提取率为68.08%。与理论值相接近，说明通过响应面优化后的回归模型能够预测实际提取率。

2.3 脱蛋白试验结果

每次脱蛋白的蛋白脱除率及多糖保留率见图7。

图7 酶法+Sevage 法的脱蛋白效果Fig.7 Effect of enzymatic assisted sevage on deproteination

多糖液经木瓜蛋白酶酶解后，蛋白质脱除率可达28.25%，同时多糖保留了96.52%。再用Sevage 试剂处理4 次，可以脱除79.85%的蛋白质，且多糖损失较少，达到较好的脱蛋白效果。

2.4 体外活性研究结果

2.4.1 对α-淀粉酶活力抑制作用

不同多糖浓度下α-淀粉酶活力的抑制率见图8。

图8可以看出藜麦多糖对α-淀粉酶活力的抑制率与其浓度有一定的剂量依赖[22]，随着多糖浓度的增加，抑制率也显著提高，在多糖浓度1 mg/mL 左右达到最高抑制率，随着多糖浓度的继续增加，在抑制效果相近的情况下，过量的多糖反而降低了其利用率，抑制率也降低。

图8 梯度浓度藜麦多糖对α-淀粉酶活力的抑制作用Fig.8 The inhibitory effect of Chenopodium quinoa polysaccharide on the activity of alpha-amylase

2.4.2 DPPH 自由基清除率

不同多糖浓度下DPPH 自由基清除率见图9。

图9 DPPH 自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Fig.9 The scavenging effect of different concentration Chenopodium quinoa polysaccharides on DPPH free radicals

由图9可观察出，藜麦粗多糖对DPPH 自由基有一定的清除效果，其清除能力远低于Vc，随其浓度的增加，清除率缓慢上升。当多糖提取液浓度为3 mg/mL时，DPPH 自由基清除率可达28.81%。

2.4.3 羟自由基清除率

不同多糖浓度下羟自由基清除率见图10。

图10 羟自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Fig.10 Effect of different concentrations of Chenopodium quinoa polysaccharides on hydroxyl radical scavenging

羟自由基一般存活时间较短，反应活性较高。图10可以直观地看出羟自由基清除率随多糖浓度的增加有着明显的升高，且藜麦多糖对羟自由基清除效果显著，在浓度为3 mg/mL 时清除率可达72.1%。

2.4.4 ABTS+自由基清除率

不同多糖浓度下ABTS+自由基清除率见图11。

图11 ABTS+自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Fig.11 Effect of different concentration Chenopodium quinoa polysaccharides on the scavenging of ABTS+free radical

ABTS 在氧化剂作用下生成绿色的ABTS+自由基，当抗氧化物存在时ABTS+自由基的产生会被抑制。从图11可以看出，藜麦粗多糖对ABTS+自由基清除效果较为一般，且随剂量的增加效果变化不明显，在浓度为6 mg/mL 时清除效果最佳，可清除ABTS+自由基18.1%。

3 结论

纤维素酶能够酶解藜麦细胞壁，加速多糖溶出，同时具有量少而催化效率高的特点，能够有效降低生产成本。液体中传播的超声波产生空化作用，使得细胞破碎，细胞内溶物更好地溶出。但是采用此法的同时，也可能使多糖降解，应该在多糖提取率显著提高的条件下，尽可能缩短超声时间，降低超声温度来减少超声波的机械剪切作用对多糖造成的损坏。酶法辅助超声波提取法可以明显提高藜麦多糖的提取率，通过对比试验表明，经酶法辅助超声波提取比单一采用超声波提取，多糖提取率增加1.5 倍。

寻求可替代的天然无毒的抗氧化剂是当前食品领域研究的热点，就藜麦多糖而言，对不同自由基清除率差异较大，其中对羟自由基清除效果最为显著。此外，藜麦多糖对α-淀粉酶活力具有一定的抑制作用，能有效地阻碍碳水化合物水解，试验结果为开发藜麦资源提供参考，为进一步开拓糖尿病人食品提供理论依据。