原花青素白藜芦醇浆对大鼠酒精性脑损伤的预防性保护作用研究

杨艳，刘青青，李永儒，李高婷，刘浪飘，彭云，谢惠波，*

（1.西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，四川泸州646000；2.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州646000）

抗氧化”是保健食品的重要功能之一。酒精干扰组织氧化应激防御系统，引起细胞膜中类脂和蛋白质的结构变化，改变神经细胞膜的流动性和三磷酸腺苷的活性，阻碍钙的运输，引起神经细胞功能障碍，导致神经细胞死亡[1-3]。作为一种亲脂性小分子毒性物质，酒精对中枢神经和周围神经均可造成损伤，尤其容易透过血脑屏障作用于脑部，造成大脑神经细胞的损伤[4]。神经系统是酒精损伤的主要靶器官。目前，尚无治疗酒精中毒所致脑损伤的有效药物，因而预防极为重要。原花青素白藜芦醇浆是以野生山枇杷为原料研发而成的一种保健食品，因含有原花青素（procyanidins）和白藜芦醇（resveratrol）而命名。原花青素和白藜芦醇两者具有抗氧化、保护心血管、调节免疫活性、保肝、抗诱变、抗癌等多种生物活性作用[5-8]。研究采用白酒灌胃建立酒精性脑损伤大鼠模型，探讨原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤的保护作用，为合理开发利用野生山枇杷提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD 大鼠50只，雄性，体重为180 g～200 g，由西南医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证SCXK（川）2013-17；实验动物使用许可证SYXK（川）2013-065；野生山枇杷果实采集自四川古蔺县赤水河流域地区，由西南医科大学药学院鉴定，由四川古蔺吉利果品有限公司制成原花青素白藜芦醇浆，原花青素白藜芦醇浆为暗红色的黏稠液体，经四川大学公共卫生学院检测该产品含有原花青素1.28 %，白藜芦醇1.26 mg/L；52°红星二锅头白酒：北京红星股份有限公司；总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、钙离子（Ca2+）、总蛋白（total protein，TP）、羟自由基、三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphate，ATPase）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Versamax 连续波长酶标仪：美国分子仪器公司；UV-2450 紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；5810 R 冷冻型台式大容量高速离心机：德国eppendorf 公司；LD4-2A 型台式低速离心机：北京众益中和生物技术有限公司；HH-8 数显恒温水浴锅：中国常州国华电器有限公司；LRH-150 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GI54DWS 全自动高压灭菌器：美国致微仪器股份有限公司；DHG-9240A 鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

50只雄性的SD 大鼠随机均分为5 组，其中4 组造酒精性脑损伤大鼠模型，分别为模型组、原花青素白藜芦醇浆低、中、高剂量干预组，另设正常对照组。

1.3.2 造模及干预剂量

造模参照钟飞等的方法进行[9]，第1 天～第6 天进行适应性喂养，第7 天～第14 天灌胃：每日禁食不禁水6 h 后，进行灌胃操作。干预组低、中、高剂量组分别按人体推荐剂量（3 g/人，为生产者提供的人均量）的10、30、90 倍按0.5、1.5、4.5 g（/kg·bw）以10 mL/kg 灌服大鼠原花青素白藜芦醇浆[10]，模型组和正常组灌服同体积蒸馏水；1 h 后，干预组和模型组灌胃红星二锅头，第7 天剂量为7 mL/kg，第8 天～第14 天为10 mL/kg，正常组灌服同体积蒸馏水。灌胃结束后恢复饮食。从适应性喂养开始每天记录大鼠体重，并观察记录大鼠的一般情况。某日体重增长幅度/%=（某日体重－初始体重）/初始体重×100（初始体重为实验第1 天体重）

1.3.3 标本采集、制备、检测

大鼠末次灌胃后禁食12 h～16 h，第15 天按体重腹腔注射2%戊巴比妥钠45 mg/kg（2.25 mL/kg）麻醉，腹主动脉血，3 000 r/min 离心10 min 后取上层血清按试剂盒说明检测SOD、MDA。采血完毕后处死大鼠，取脑组织用生理盐水漂洗，滤纸拭干，精确称量脑组织块制备10%匀浆液，4 ℃3 000 r/min 离心10 min 取上清液，按试剂盒说明检测TP、SOD、GSH-Px、MDA、羟自由基、Ca2+、ATP 酶。规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP 酶分解ATP 产生1 μmol 无机磷的量为一个ATP 酶活力单位，即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（μmolPi/mgprot/hour）。脑组织匀浆蛋白定量采用考马斯亮蓝染色法测定。

1.4 统计学处理

用Excle 2007 录入并整理实验数据，SPSS 22.0 软件进行分析。计量资料用（±s）表示，多样本均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般情况

正常对照组大鼠毛色光滑、活泼、体重持续增长。模型组大鼠毛色无光泽，有不同程度精神萎靡，食欲不振，体重增长缓慢。实验观察到，大鼠在酒精灌胃后出现不自主行为增多、嗜睡等状态，个别翻正反射阳性。干预组较模型组有不同程度改善。

2.2 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠体重的影响

原花青素白藜芦醇浆对酒精中毒大鼠体重增长幅度的影响见表1。

表1 原花青素白藜芦醇浆对酒精中毒大鼠体重增长幅度的影响（±s，n=10）Table 1 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on the weight gain range of alcoholic brain damage rat（±s，n=10） %

表1 原花青素白藜芦醇浆对酒精中毒大鼠体重增长幅度的影响（±s，n=10）Table 1 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on the weight gain range of alcoholic brain damage rat（±s，n=10） %

注：*为与正常对照组比较P＜0.05，差异显著；#为与模型对照比较P＜0.05，差异显著；△为与低剂量比较P＜0.05，差异显著；▲为与中剂量比较P＜0.05，差异显著。

实验时间 正常对照组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组第5 天 19.71±1.37 19.09±1.74 18.85±1.85 18.89±1.55 20.12±1.03第9 天 38.57±3.54 29.79±4.62* 27.38±7.62* 34.38±4.50*△ 36.26±3.84#△第12 天 51.75±5.48 36.91±5.88* 33.81±8.91* 44.54±5.33*#△ 48.05±5.67#△第15 天 54.54±6.34 33.36±8.27* 33.25±9.36* 45.55±4.91*#△ 51.68±6.01#△▲

灌胃操作实验前（第5 天）各组大鼠体重增长幅度无差异（F=1.318，P=0.278）。实验9 d 和12 d（灌胃进行的第3 天和第6 天）和15 d（处死大鼠日），模型组大鼠体重增长幅度低于正常对照组（P＜0.05）。实验第9天、第12 天、第15 天，低剂量组体重变化幅度与模型组无差异（P＞0.05），中、高剂量组体重变化幅度均高于模型组和低剂量组（P＜0.05）；第15 天，高剂量组体重增长幅度均高于低、中剂量组（P＜0.05），3 个剂量组之间存在差异并呈剂量相关性。

各组大鼠体重增长幅度随时间的变化趋势见图1。

图1 各组大鼠体重增长幅度变化趋势Fig.1 Trends of weight gain range in each group of rats

实验第5 天到第12 天，各组大鼠体重逐渐增加，正常对照组体重增长幅度最大，其次是高剂量组，中剂量组居于第三位，低剂量组与模型组体重增长幅度相当且最小。实验第12 天到第15 天，正常对照组、高中剂量组体重增长趋势不变，增长幅度变小，低、中剂量组与模型组体重呈现降低趋势，低、中剂量组降低幅度相当，模型组降低幅度相对较大。

2.3 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠血清SOD、MDA 的影响

原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠血清SOD、MDA 的影响见表2。

表2 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠血清SOD、MDA的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on serum SOD，MDA of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

表2 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠血清SOD、MDA的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on serum SOD，MDA of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

注：*为与正常对照组比较P＜0.001，差异极显著；#为与模型对照比较P≤0.005，差异显著；△为与低剂量比较P＜0.05，差异显著。

组 别 SOD/（U/mL） MDA/（nmol/mL）正常对照组 353.51±16.08 3.04±0.20模型组 251.29±15.49* 4.63±0.30*低剂量组 271.91±19.35*# 3.97±0.39*#中剂量组 289.82±13.32*#△ 3.66±0.38*#△高剂量组 297.55±12.48*#△ 3.58±0.19*#△

模型组与3 个干预组血清SOD 显著低于正常对照组，MDA 显著高于正常对照组（P＜0.001）。与模型组比较，3 个干预组血清SOD 均升高，MDA 均降低（P≤0.005），SOD 呈现随干预剂量增大而升高趋势，而MDA 随干预剂量增大有降低趋势。其中，中、高剂量组血清SOD 显著高于低剂量组，MDA 显著低于低剂量组（P<0.05）。

2.4 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠脑匀浆SOD、GSH-Px、MDA 和抑制羟自由基能力的影响

原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆SOD、GSH-Px、MDA、抑制羟自由基能力的影响见表3。

模型组、3 个干预组脑匀浆SOD、GSH-Px 和抑制羟自由基能力均显著低于正常对照组，MDA 显著高于正常对照组（P<0.05）。与模型组比较，3 个干预组脑匀浆SOD、GSH-Px 和抑制羟自由基能力均升高，MDA 均注：*表示与正常组比较P＜0.05，差异显著；#表示与模型组比较P＜0.005，差异显著；△表示与低剂量组比较P＜0.05，差异显著；▲表示与中剂量组比较P＜0.05，差异显著。降低（P<0.005），SOD、GSH-Px 和抑制羟自由基能力呈现随干预剂量增大升高趋势，而MDA 随干预剂量增大有降低趋势。其中，高剂量组脑匀浆SOD 和抑制羟自由基能力显著高于低剂量组，GSH-Px 显著高于低、中剂量组，MDA 显著低于低、中剂量组（P<0.05）。

表3 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆SOD、GSH-Px、MDA、抑制羟自由基能力的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on brain homogenate SOD，GSH-Px，MDA and the suppression ability of hydroxyl free radical of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

表3 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆SOD、GSH-Px、MDA、抑制羟自由基能力的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of procyanidins resveratro1 pulp on brain homogenate SOD，GSH-Px，MDA and the suppression ability of hydroxyl free radical of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

组 别 SOD/（U/mgprot） GSH-Px/（U/mgprot） MDA/（nmol/mgport） 抑制羟自由基能力/（U/mgprot）正常对照组 300.548±18.535 27.652±1.364 3.147±0.844 5.818±0.372模型组 209.276±18.054* 20.090±1.295* 6.757±0.656* 3.402±0.516*低剂量组 258.213±15.987*# 21.768±1.393*# 4.791±0.645*# 4.360±0.407*#中剂量组 266.333±20.652*# 23.371±0.895*#△ 4.586±0.625*# 4.832±0.406*#△高剂量组 279.440±16.414*#△ 25.005±1.111*#△▲ 3.935±0.685*#△▲ 5.098±0.207*#△

2.5 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤大鼠脑匀浆Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的影响

原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的影响见表4。

表4 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的影响（±s，n=10）Table 4 Effects of procyanidins resveratro1 Pulp on brain homogenate Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATPase of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

表4 原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑伤大鼠脑匀浆Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的影响（±s，n=10）Table 4 Effects of procyanidins resveratro1 Pulp on brain homogenate Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATPase of alcoholic brain damage rat（±s，n=10）

注：*表示与正常组比较P＜0.001，差异极显著；#表示与模型组比较P＜0.05，差异显著；△表示与低剂量组比较P＜0.05，差异显著；▲表示与中剂量组比较P＜0.05，差异显著。

组 别 Ca2+/（mmol/gprot） Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力/（μmolPi/mgprot/hour）正常对照组 0.047±0.005 1.010±0.088模型组 0.100±0.012* 0.587±0.059*低剂量组 0.089±0.009*# 0.634±0.072*中剂量组 0.074±0.009*#△ 0.741±0.085*#△高剂量组 0.068±0.010*#△ 0.828±0.071*#△▲

与正常对照组相比，模型组、3 个干预组脑匀浆Ca2+均显著升高，Ca2+-Mg2+-ATP 酶均显著降低（P<0.001）。与模型组比较，3 个干预组脑匀浆Ca2+均降低，Ca2+-Mg2+-ATP 酶均升高（P<0.05），Ca2+呈现随干预剂量增大降低趋势，而Ca2+-Mg2+-ATP 酶随干预剂量增大有升高趋势。其中，中、高剂量组脑匀浆Ca2+低于低剂量组，3 个干预组间Ca2+-Mg2+-ATP 酶差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 结论与讨论

长期大量饮酒或酗酒会损害人体健康，可导致人多器官、系统的损伤，出现一系列健康问题。酒精容易透过血脑屏障作用于大脑，造成大脑神经细胞的损伤，可引起精神障碍、大脑萎缩、智力障碍等精神行为症状[4，10]。实验中观察到模型组大鼠活力下降，食欲状态欠佳、嗜睡，翻正反射阳性，大鼠酒精灌胃后所表现出的精神、行为障碍与人类酒精中毒表现相似。各干预组大鼠精神、行为障碍较模型组有不同程度减轻，表明原花青素白藜芦醇浆对酒精性脑损伤具有一定程度的预防性保护作用。同时，实验发现，酒精灌胃前各组大鼠体重变化幅度无差异，酒精灌胃初期，正常对照组体重增长幅度最大，其次是高剂量组，中剂量组居于第三位，低剂量组与模型组组体重增长幅度相当且最小。实验末期，高剂量组体重增长幅度高于中、低剂量组，3 个剂量组之间存在差异并呈剂量相关性。提示酒精灌胃影响大鼠食欲和胃肠消化，使得大鼠体重增长速度减慢，而原花青素白藜芦醇浆有助于减弱酒精对大鼠食欲和胃肠消化的影响，从而对酒精性脑损伤发挥预防性保护作用。

乙醇代谢产生的氧自由基增多，氧自由基具有强氧化能力，会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，并产生脂质过氧化产物[11]。氧自由基是指由氧衍生出来的自由基及其产物，包括羟自由基、过氧化氢、超氧阴离子等。其中，羟自由基被认为是生物系统中最具活性的活性氧物种，能导致生物体内脂质氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解。样品中羟自由基的含量越高，则抑制羟自由基能力越低。SOD 和GSH-Px 是机体内广泛存在的清除过氧化物代谢产物的抗氧化酶，阻断脂质过氧化，反映机体抗氧化能力[12-13]。MDA 是脂质过氧化反应的终产物，测定其含量可间接推断自由基对机体的损伤程度[14]。实验发现，模型组血清SOD活力显著降低而MDA 含量显著升高，脑SOD、GSH-Px活力显著降低而MDA 含量显著升高，抑制羟自由基能力明显降低。表明酒精中毒时，羟自由基等氧自由基增多，攻击生物膜，因而脂质过氧化物生成增多，为清除过多的氧自由基，SOD、GSH-Px 活力下降，说明酒精灌胃造成大鼠脑细胞氧化损伤。与模型组比较，用原花青素白藜芦醇浆干预后，大鼠的氧化损伤减轻，血清SOD 活力升高，MDA 含量降低，脑组织MDA 含量降低，SOD、GSH-Px 活力和抑制羟自由基能力升高，且呈现一定剂量反应关系，说明原花青素白藜芦醇浆对急性酒精中毒所致的脑损伤具有预防性保护作用。

乙醇代谢引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，导致线粒体膜损伤和通透性的改变而诱发细胞损伤[15]。ATP 酶是存在于组织细胞及细胞器生物膜上的一种蛋白酶，神经元细胞膜内外的正常离子梯度有赖ATP 酶的主动转运进行离子交换，维持细胞内外水电解质平衡，在物质运送、能量转换、信息传递等方面起着重要作用。Ca2+-Mg2+-ATP 酶是重要的ATP 酶之一，能够直接利用ATP 为能源，逆浓度梯度主动把细胞内液的Ca2+泵出膜外，以维持胞内Ca2+的低稳态，从而保证神经细胞的正常兴奋性。有研究表明，Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低必然影响胞浆和胞内Ca2+稳态，导致胞内Ca2+的蓄积，细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）升高，从而影响神经细胞动作电位的产生与兴奋性传导，产生一定的中枢抑制效应[16]。实验发现，与正常对照组比较，模型大鼠脑组织Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力显著降低，[Ca2+]i显著升高，说明由于氧自由基增多，脑细胞损伤，Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低，使细胞内Ca2+的排出发生障碍，造成钙稳态失调。经原花青素白藜芦醇浆干预的急性酒精中毒大鼠脑组织Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力均升高，[Ca2+]i显著下降，且呈现一定剂量反应关系，提示原花青素白藜芦醇浆对急性酒精中毒所致的脑损伤具有预防性保护作用。

综上所述，原花青素白藜芦醇浆降低酒精造成的大鼠血清SOD 耗竭水平，减少MDA 生成；降低脑组织SOD、GSH-Px 耗竭水平，减少MDA 的生成，提高抑制羟自由基能力，对抗Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力降低及Ca2+过度内流，避免脑细胞由于酒精氧化应激造成的损害；减轻酒精造成的大鼠精神、行为障碍，减弱酒精对大鼠食欲和胃肠消化的不利影响，对急性酒精中毒所致的脑损伤具有预防性保护作用。