超声破碎辅助提取灵芝多糖工艺优化及抗氧化活性研究

田淑雨，鹿士峰，吴杨洋，杜秀菊

（聊城大学生命科学学院，山东聊城252000）

灵芝（Ganoderma lucidum）又名黑芝、赤芝、紫芝、万年蕈、灵芝草等，在分类学系统上隶属于担子菌门（Hymenomyeetes），多孔菌目（Polyporace），灵芝科（Ganodermataceae），灵芝属（GanodermaP.Kars）[1-2]，灵芝含有多种活性物质，主要成分包括多糖类、多肽类、三萜类物质、生物碱、无机离子、油脂类、呋喃类、甾醇类等，对于灵芝的开发和利用可以追溯到两千年前，据《神农本草经》记载，灵芝具有延年益寿，补气安神，止咳平喘等多种功效，在民间更是流传着灵芝起死回生的神奇传说[3-5]。

灵芝多糖（G.lucidumpolysaccharide，GLP）是灵芝的主要活性物质之一，近年来，许多学者都提出灵芝多糖具有抗肿瘤[9]、抗氧化[10]、抗衰老、提高机体免疫力、提高记忆力[11]、降血糖、降血脂[12]、抗辐射[13]、抑制血栓形成、活血化瘀、抗病毒等功效[6-8]，灵芝多糖能够有效地清除体内羟自由基，超氧阴离子，并且具有一定的还原力，对超氧化物歧化酶也具有一定的作用[14]，已分离的灵芝200 多种，仅仅数十种结构被报道，构效关系不明确，且提取得率也有待提高。因此，对于灵芝的研究，也成为国内外争先恐后研究的热点。毛健等[6]研究表明传统提取灵芝多糖的方法操作简单，成本低，但提取时间长，效率不高；超声提取法作为一种物理破碎过程，通过超声场形成局部瞬间高压，使细胞壁和整个生物体破裂，然后产生的空化作用和机械作用能够增加分子的运动，有利于多糖析出，操作简单，提取率高，反应过程无物料损失，回收率相对较高[15]。

本文旨在对超声破碎辅助提取灵芝多糖的工艺进行优化，获得最优提取方式，比较灵芝多糖的抗氧化活性，体外筛选最优抗氧化活性部位，为灵芝的开发和利用提供科学的理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝：山东聊城冠县；浓硫酸（H2SO2）、苯酚（Phenol）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、 过 氧 化 氢（H2O2）、 无 水 乙 醇（CH3CH2OH）、三氯化铁（FeCl3·6H2O）：均为分析纯，莱阳经济技术开发区精细化工厂；DPPH：分析纯Solarbio公司；抗坏血酸：天津市红岩试剂厂。

1.2 仪器与设备

超声波破碎仪（JY92-IIN 型）：宁波新芝生物科技有限公司；可见光分光光度计（WF-J2100 型）：上海尤尼柯仪器有限公司；低速离心机（LD4-2 型）：北京医用离心机厂；磁力加热搅拌器（78-1 型）：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；循环水式多用真空泵（SHZDIII）：郑州博科仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理

灵芝子实体烘干（60 ℃）至恒重→粉碎过100 目筛→按15：1（mL/g）液料比加入95%无水乙醇→浸泡24 h，重复两次，滤渣自然烘干后留取备用。

1.3.2 多糖和蛋白含量分析

苯酚-硫酸法测定总糖含量[16]、二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法测定还原糖含量[17]、考马斯亮蓝法测定蛋白含量[18-19]。

多糖含量（%）=总糖含量（%）－还原糖含量（%）

1.3.3 单因素试验

据文献[20-21]的研究方法略作改动。选取液料比、提取时间、提取功率进行单因素试验，考察各因素对灵芝多糖得率的影响。

1.3.3.1 液料比对灵芝多糖得率的影响

准确称取3 g 灵芝子实体，分别按照液料比10：1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 （mL/g）溶解于蒸馏水中，混匀，静置3 min，500 W 超声破碎40 min，冷却至室温，7 000r/min，15 min 离心2 次，醇沉（酒精浓度至80%），4 ℃冰箱内过夜，7 000 r/min，10 min 离心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得灵芝多糖。

1.3.3.2 提取时间对灵芝多糖得率的影响

准确称取3 g 灵芝子实体，按照液料比20 ∶1（mL/g）溶解于蒸馏水中，混匀，静置3 min，500 W 超声功率分别破碎30、40、50、60、70 min，冷却至25 ℃，7 000 r/min，15 min 离心2 次，醇沉（酒精浓度至80%），4 ℃冰箱内过夜，7 000 r/min，10 min 离心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得灵芝多糖。

1.3.3.3 提取功率对灵芝多糖得率的影响

准确称取3 g 灵芝子实体，按照液料比20 ∶1（mL/g）的比例溶解于蒸馏水中，混匀，静置3 min，分别以300、400、500、600、700、800 W 的超声功率破碎40 min，7 000 r/min，15 min 离心2 次，醇沉（酒精浓度至80%），4 ℃冰箱内过夜，7 000 r/min，10 min 离心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得灵芝多糖。

1.3.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，运用运用Design-Expert 8.0.5 软件，设计Box-Behnken 试验，采用三因素三水平响应面分析试验[22-23]，因素水平表见表1。

表1 响应面设计因素与水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.4 乙醇分级沉淀灵芝多糖

取一定量的灵芝多糖浓缩液，加入无水乙醇，溶液浓度至40%，静置，4 ℃冰箱过夜，7 000 r/min 离心20 min，收集沉淀，上清液留取备用，60 ℃干燥，得灵芝多糖，即为GLP40；取留取待用的上清液，继续添加无水乙醇，溶液浓度至60%，静置，4℃冰箱过夜，7 000 r/min离心20 min，收集沉淀，上清液留取备用，60 ℃干燥，得灵芝多糖，即为GLP60；取留取待用的上清液，继续添加无水乙醇，溶液浓度至80 %，静置，4 ℃冰箱过夜，7 000 r/min 离心20 min，收集沉淀，上清液留取备用，60 ℃干燥，得灵芝多糖，即为GLP80[24]。

1.3.5 抗氧化活性试验

1.3.5.1 不同浓度供试液的制备

准确称取0.02 g 的灵芝多糖，溶解于10 mL 蒸馏水，配置浓度为2 000 μg/mL 的多糖溶液→取4.5 mL 2 000 μg/mL 多糖溶液溶于1.5 mL 蒸馏水，配置浓度为1 500 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 2 000 μg/mL 多糖溶液溶于5 mL 蒸馏水，配置浓度为1 000 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 1 000μg/mL 多糖溶液溶于5 mL蒸馏水，配置浓度为500 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 500 μg/mL 多糖溶液溶于5 mL 蒸馏水，配置浓度为250 μg/mL 的多糖溶液→重复以上操作，至浓度为62.5 μg/mL。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除活性

据文献[25-27]的方法，略作改动。依次往试管中加入：灵芝多糖样品液（1 mL）→0.2 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，在避光条件下反应30 min→在预热好的可见光分光光度计中，测其吸光度值（517 nm）为Ai；灵芝多糖样品液（1 mL）→无水乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，避光条件下反应30 min→在预热好的可见光分光光度计中，测其吸光度值（517 nm）为Aj；0.2 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液（1 mL）→无水乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，在避光条件下反应30 min→在预热好的可见光分光光度计中，测其吸光度值（517 nm）为A0，相同方法VC作阳性对照，3 次试验。DPPH 自由基清除率计算公式为：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

式中：A0为空白对照组的吸光度；Ai为加入多糖溶液后的吸光度；Aj为待测液本底的吸光度。

2.危害性。高校突发事件通常都具有较高的危害性，对学校带来的影响较大，不仅可能会影响到学校正常教学工作的开展，而且可能会对学校师生的思想观念造成较大的冲击，对后期教学工作造成影响。甚至该类型事件还可能被一些不法分子利用，对社会的稳定带来较大的影响。

1.3.5.3 羟自由基清除活性

据文献[28-29]的方法，略作改动。依次往试管中加入：4 mmol/L 30%H2O2溶液（1 mL）→超纯水（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→4 mmol/L 水杨酸乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，37 ℃下避光恒温保持30 min→离心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在预热好的可见光分光光度计中，测溶液的吸光度值（510 nm）为A0；4 mmol/L 30 % H2O2溶液（1 mL）→灵芝多糖样品液（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→4 mmol/L 水杨酸乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，37 ℃下避光恒温保持30 min→离心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在预热好的可见光分光光度计中，测溶液的吸光度值（510 nm）为Ai；4 mmol/L 30%H2O2溶液（1 mL）→灵芝多糖样品液（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→乙醇溶液（1 mL）→混合均匀，37 ℃下避光恒温保持30 min→离心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在预热好的可见光分光光度计中，测溶液的吸光度值（510 nm）为Aj，相同方法VC作阳性对照，3 次重复，取平均值，清除羟基自由基计算公式是：

羟基自由基清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

式中：A0为空白对照组的吸光度；Ai为加入多糖溶液后的吸光度；Aj为待测液本底的吸光度。

1.3.5.4 还原力测定

据据文献[30-31]的方法，略作改动。依次往试管中加：灵芝多糖供试样品液（1 mL）→1 %铁氰化钾溶液（2 mL）→2 mol/L pH值为6.60 的磷酸盐缓冲液（2 mL）→混合均匀，恒温培养20 min→10 %三氯乙酸溶液（2 mL）→离心（3 000 r/min，10 min）→上清液（2.5 mL）→超纯水（2.5 mL）→0.1%的三氯化铁溶液（1 mL），混合均匀，静置10 min→测吸光度值为A（700 nm），相同方法VC作阳性对照，3 次试验，取平均值，吸光度值数值越大还原力也就越强。

2 结果与分析

2.1 含量分析

灵芝粗多糖（GLP40、GLP60、GLP80）的总糖含量、还原糖含量、蛋白含量如表2所示，GLP40、GLP60、GLP80含量各不相同，可能对抗氧化活性造成一定的影响。

表2 多糖含量分析Table 2 Analysis of the content of poly saccharide

2.2 单因素试验结果与分析

图1为灵芝多糖提取的单因素试验结果。

图1 灵芝多糖提取的单因素试验Fig.1 The signal-factor result of yield of the polysaccharide from G.lucidum

2.2.1 液料比对灵芝多糖得率的影响

由图1（a）可知，随着液料比的不断增加，灵芝多糖得率不断增加，当液料比增加到20 ∶1（mL/g），提取得率反而降低，原因可能是因为溶剂太多，多糖浓度偏低，醇沉不够完全，因此，本试验选取20 ∶1（mL/g）的液料比较为合适。

2.2.2 提取时间对灵芝多糖得率的影响

由图1（b）可知，随着提取时间的不断增加，提取得率不断增加，在提取时间为50 min 时提取得率最高，随着时间的增加，提取得率反而降低，可能由于时间过长导致多糖的分解，因此，从缩短生产周期，增加提取效果等方面综合考虑，本试验选定提取时间在50 min 左右。

2.2.3 提取功率对灵芝多糖得率的影响

由图1（c）可知，随着提取功率的不断增加，提取得率也不断增加，在提取功率为700 W 具有最高值，此后随着提取功率的增加，提取得率反而降低，可能是因为超声破碎过长时间，导致多糖结构被破坏，因此，本试验选定提取功率在700 W 左右。

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面试验结果与分析

根据Box—Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验结果基础上，对超声破碎提取灵芝多糖进行响应面优化试验，试验方案及结果见表3。利用Design—Expert 8.0.5 软件对表3 数据进行多元回归拟合和显著性分析，结果见表4。响应面分析的二次回归方程为：Y=2.58+0.42A+0.31B+0.27C+0.24AB+0.32AC+0.33BC-0.10A2+0.067B2-0.092C2。

表3 响应面试验方案与结果Table3 Scheme and results of the response surface test

表4 响应面结果方差分析Table 4 analysis of variance of the response surface results

续表4 响应面结果方差分析Continue table 4 analysis of variance of the response surface results

根据表4可知，模型的P值＜0.01，表明回归方程模型极其显著，失拟项P＞0.05，且相关系数R2=0.942 2，失拟项不显著，表明该模型能够反应响应值的变化，试验拟合好，失拟小，预测值与实际值具有高度的相关性，可直接采用回归方程对超声破碎提取灵芝多糖工艺进行分析和预测。在各因素之中A、B的P值＜0.01，说明对试验结果影响极其显著，C的P值＜0.05，说明对试验结果影响显著，二次项C2的P值＜0.01，影响极其显著，交互项指标BC的P值＜0.01，说明结果极其显著，AC的P值＜0.05，影响显著。根据F 值的大小可判断各因素对试验结果的影响顺序为：A＞B＞C，即液料比＞提取时间＞提取功率，响应面优化所得最佳提取条件为液料比25 ∶1（mL/g）、超声时间60 min、超声功率760 W，灵芝多糖的预测提取得率为3.78%，实际提取得率3.68%，与理论值相差0.10%。

2.3.2 各因素交互作用

各因素之间的交互作用见图2。

将其中一个因素固定为0，可得另外两个因素之间的交互作用影响结果，由图2（b）可知，随着提取功率和液料比的增加，提取得率也不断的增加，当增加到一定程度，提取得率反而降低，由图2（c）可知，随着提取功率和提取时间的不断增加，提取得率也不断的增加，当到达一定范围，提取得率反而下降，交互作用显著，与试验模型分析相一致。

图2 液料比、超声时间、超声功率对灵芝多糖提取得率的影响Fig.2 The yield of G.lucidum polysaccharide between the material-liquid ratio and ultrasonic power，ultrasonic time and material-liquid ratio，ultrasonic power and ultrasonic power

2.4 不同体积分数乙醇分级醇沉灵芝多糖

不同体积分数乙醇分级醇沉灵芝多糖，所得GLP40 多糖比例最大，约占醇沉多糖总含量的45%，其次是GLP60，约占醇沉多糖总含量29%，最后是GLP80 多糖，约占醇沉多糖总含量的26 %，GLP40、GLP60 约占醇沉多糖总量74%，出现这种现象的原因可能是灵芝多糖浓缩液先经40 %和60 %的乙醇沉淀，再经80%乙醇沉淀，导致先醇沉的多糖含量较高；也可能和多糖的分子量有关，分子量大的多糖，先醇沉出来，分子量小的多糖后醇沉出来。

2.5 抗氧化活性试验

2.5.1 DPPH 自由基清除试验

以VC为阳性对照，分级后灵芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分级灵芝多糖（GLP）的体外清除DPPH 自由基的活性结果如图3（a）所示，5 种多糖的确具有清除DPPH 自由基的能力，且随着浓度的不断增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），清除能力不断增加，在浓度和清除率之间有着良好的正相关关系，多糖EC50值如表5所示，DPPH 自由基清除力大小排列顺序为：Vc＞GLP80＞GLP＞GLP60＞GLP40，GLP80清除能力相对较好。

图3 灵芝多糖体外清除活性Fig.3 Scavenging activity of polysaccharide from G.lucidum in vitro

表5 4种灵芝多糖对DPPH 自由基、羟基自由基清除活性和还原力大小的EC50值Table 5 EC50 values and RP0.5AU values of DPPH-scavenging activity，Hydroxhl-scavenging activity，Reducing power of differen polysaccharide from G.lucidum（GLP80，GLP60，GLP40，GLP）

2.5.2 羟基自由基清除试验

以VC为阳性对照，分级后灵芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分级灵芝多糖（GLP）的体外清除羟基自由基的活性如图3（b）所示，该多糖的确具有清除羟自由基的能力，且随着浓度的不断增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），清除能力不断增加，浓度和清除率之间有良好的线性关系，多糖EC50值如表5所示，羟自由基清除力大小排列顺序为：VC＞GLP＞GLP40＞GLP60＞GLP80，GLP 和GLP40 清除羟自由基能力相对较好。

2.5.3 还原力试验

以VC为阳性对照，分级后灵芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分级灵芝多糖（GLP）还原力如图3（b）所示，4种多糖的确具有还原力，且随着浓度的不断增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），还原力增加，在浓度和还原力之间有良好的线性关系，多糖EC50值如表5所示，还原力大小的排序为VC＞GLP60＞GLP80＞GLP＞GLP40，GLP60 还原力相对较好。

3 结论

考察单因素液料比、提取时间、提取功率对灵芝多糖提取得率的影响，并在此基础上运用Design-Expert 8.0.5 软件进行Box-Behnken 中心组合试验，得到超声破碎法提取灵芝多糖的最优提取工艺为液料比25：1（mL/g），提取时间60 min，提取功率760 W，灵芝多糖的提取得率3.60%，试验模型的P 值＜0.01 且失拟项P＞0.05，表明模型显著，回归方程能够较好对试验结果进行预测和分析，各因素对试验结果的影响顺序为：A＞B＞C，即液料比＞提取时间＞提取功率。液料比、提取时间对试验结果影响极其显著，提取功率影响显著。响应面优化结果对于对灵芝多糖的开发和利用具有一定的意义。

采用乙醇沉淀法对灵芝多糖进行分级，所得GLP40、GLP60、GLP80 多糖比例为45：29：26，灵芝粗多 糖GLP40、GLP60、GLP80 所 对 应 的 总 糖 含 量 为15.20%、26.02%、15.52%；还原糖含量2.46%、2.43%、3.18%；蛋白含量3.98%、3.65%、2.56%。

对GLP、GLP40、GLP60、GLP80 进行DPPH 自由基清除试验、羟基自由基清除试验、还原力试验，结果显示4种多糖都具有一定的抗氧化活性，其中GLP80 清除DPPH 自由基的能力最强，GLP、GLP40 清除羟基自由基能力最强，GLP60 还原力最好，且抗氧化活性与多糖浓度有着正相关关系，随着多糖浓度的不断增加，抗氧化活性也不断增加。