类风湿关节炎患者外周血单核细胞lncRNA差异表达谱研究

2019-04-15 01:51:14 风湿病与关节炎2019年2期

刘健 万磊 孙玥 章平衡 忻凌 姜辉 方妍妍 董文哲 文建庭

【摘 要】目的:观察类风湿关节炎患者外周血单核细胞lncRNA差异表达。方法:选取安徽中医药大学第一附属医院住院类风湿关节炎患者(类风湿关节炎组)及健康体检者(正常对照组),每组3例。抽取2组研究对象的外周血,利用高通量基因测序技术检测外周血单个核细胞lncRNA和mRNA表达,GO分析及KEGG信号通路分析差异表达的lncRNA功能分布,构建lncRNA-mRNA的共表达网络,并在此基础上通过Cis和Trans预测可能与类风湿关节炎凋亡、氧化应激、信号通路相关lncRNA。利用RT-PCR方法验证lncRNA。结果:通过lncRNA测序分析发现,lncRNA在类风湿关节炎组与正常对照组存在明显差异表达。共有9158条差异表达的lncRNA(差异倍数≥2,且P≤0.05),表达上调的有5682条,下调的有3476条;差异表达的mRNA共有7895条。GO分析发现,差异表达的mRNA主要参与免疫炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、细胞代谢、细胞转录调节、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等。KEGG信号通路分析发现,差异表达的mRNA主要参与类风湿关节炎、细胞衰老、信号通路等方面。通过RT-PCR验证发现,与类风湿关节炎相关的细胞凋亡lncRNA为ENST00000619282、ENST00000637683、ENST00000511703,氧化应激为HOTAIRM1、DANCR,Notch通路为MALAT1、CARMN、LINC-PINT。结论:类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞中差异表达的lncRNA异常表达,可能与类风湿关节炎细胞凋亡、氧化应激及信号通路失衡有关。

【关键词】 关节炎,类风湿;长链非编码RNA;细胞凋亡;氧化应激;Notch信号通路;高通量基因测序

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种累及周围关节为主的多系统性、炎症性的自身免疫性疾病[1-2]。RA疾病发生发展过程中伴随着机体免疫细胞增殖和凋亡动态的失衡,氧化应激激活及包括Notch通路在内的多种信号传导通路失衡,导致免疫炎症的发生,最终促进RA疾病的发生发展[3-4]。RA发病机制目前仍不明确。随着近年来高通量基因测序技术的发展,对于RA基因表达谱的研究越来越受到学者关注。研究发现,长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)可能在RA的发病过程中起到相当重要的作用。lncRNA可能在RA机体的滑膜细胞凋亡、免疫炎症、氧化应激及信号通路传导失衡过程中起到重要作用。lncRNA是由非编码序列转录生成的长度 > 200 nt的RNA,目前尚未发现它翻译成蛋白质的功能。但是它可以通过与其他基因特异性结合,或与蛋白质形成复合物,从而发挥多种生物学功能。研究发现,RA患者中差异表达的lncRNA共有1615条[5],RA患者外周血單个核细胞(PBMCs)中呈异常表达的lncRNA有242个[6]。因此,通过观察lncRNA在RA中表达差异的变化,从而可以把lncRNA作为靶向治疗靶点以达到缓解甚至治愈RA的目的。本研究采用高通量基因测序技术筛选正常人和RA患者外周血淋巴细胞lncRNA表达谱,分析lncRNA差异表达情况,并探讨RA与lncRNA的关系,为RA寻找新的治疗靶点提供依据。

1 资 料

1.1 临床资料 选取2018年9月至2018年11月在安徽中医药大学第一附属医院就诊的住院RA患者(RA组)3例,年龄40~55岁;均符合美国风湿病学会(ACR)2010年RA诊断标准。另选同期3例健康体检者为正常对照组(NC组),年龄35~55岁。本研究获医院伦理委员会批准及患者及健康对照人群的知情同意(伦理号2018AH-19)。

1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清(四季青);人淋巴细胞分离液(南京三生生物技术股份有限公司生产);RNA提取试剂(Thermo Fisher Scientific公司);RT-qPCR试剂盒(上海近岸科技有限公司);引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,测序、图像采集、数据分析由雨希生物科技(上海)有限公司完成。

2 方 法

2.1 细胞收集 采集RA组和NC组外周静脉血10 mL,离心。利用淋巴细胞分离液进行分选,血细胞分析仪进行细胞计数及淋巴细胞的纯度检测。下层血细胞用淋巴细胞分离液梯度离心,分离获得PBMCs用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞,-80 ℃冻存备用。

2.2 测序类型的选择 采用测序平台的双端151 bp测序模式对样本进行去核糖体rRNA的RNA测序,利用软件对测序数据从3'端动态去除接头序列片段和低质量片段,利用软件对预处理数据进行质量控制分析以及统计Q20、Q30的碱基比例。然后去除第1端序列前5 bp,采用软件将预处理数据依次比对于rRNA序列数据库。可同时对lncRNA和mRNA进行检测,并挖掘出两者的关联。

2.3 总RNA提取 分别提取RA组和NC组淋巴细胞中的总RNA后,纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳,对总RNA进行定量和质量分析。

2.4 lncRNA表达谱分析 对3例RA患者和3例健康体检者进行高通量基因测序分析。lncRNA表达谱分析由雨希生物科技(上海)有限公司完成。针对mRNA和lncRNA转录本,根据样本的实验设计,利用软件对不同样本组之间筛选差异表达的转录本。靶基因转录本(GO)分析描述差异表达的mRNAs功能属性。京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析差异表达mRNAs生物学途径。顺势(Cis)、反式(Trans)靶标预测可能与RA 发生相关的lncRNA。

2.5 RT-PCR验证 以3例RA患者和3例健康体检者为研究对象,在筛选出来的差异表达lncRNA中,挑选差异倍数较大的lncRNA,以内参(β-actin)作为参照,采用荧光染料掺入相对定量法进行RT-qPCR验证。引物序列见表1。按照RNA提取说明提取RA组和NC组RNA,反转录cDNA及PCR扩增,最后计算2-△△CT。

3 结 果

3.1 总RNA样本质量分析 通过采用illuminaNovaseq6000测序仪检测,对每个RNA样本的碱基位置、长度等分析,均达到质检标准,能够满足实验需要。

3.2 差异表达的lncRNA和mRNA 通过lncRNA测序分析发现,lncRNA在RA组与NC组存在明显差异表达。共有9158条差异表达的lncRNA(差异倍数≥2,且P≤0.05),表达上调的有5682条,下调的有3476条;差异表达的mRNA共有7895条。

分别对其中表达上调、下调倍数最明显的20条lncRNA和mRNAs进行聚类分析图显示,可直观地看到2组lncRNAs与mRNAs的表达差异,同组样本聚在一起,说明样本间基因表达趋势一致。红色到绿色,颜色越深代表差异越明显。

3.3 生物信息学分析 GO分析发现,差异表达的mRNA主要参与免疫炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、细胞代谢、细胞转录调节、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等功能。KEGG信号通路分析显示,差异表达的mRNA主要参与RA、细胞衰老、信号通路等方面功能的基因有显著变化。并在此基础上经Cis、Trans预测,RA细胞凋亡方面,与B细胞淋巴瘤(BCL)2L14、BCL2L13、核转录因子-κB1(NF-κB1)、信号通路(Notch通路)密切相关的mRNA为白细胞介素(IL)-15、IL-6、人白细胞抗原DRB5(HLA-DRB5)等。因此与之相关的lncRNA细胞凋亡为ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703;氧化应激为HOTAIRM1、DANCR;Notch通路为MALAT1、CARMN、LINC-PINT。

3.4 qRT-PCR对lncRNA验证

3.4.1 细胞凋亡相关 lncRNA验证 选取与RA关系密切却差异表达较为显著的lncRNA(主要包括ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703)进行PCR扩增验证,结果显示,与高通量测序检测结果一致,ENST00000619282、ENST00000637683表达上调,ENST00000511703下调。

3.4.2 氧化应激相关lncRNA验证 选取与RA氧化应激方面关系最为密切且表达差异较为显著的lncRNA HOTAIRM1、DANCR进行PCR扩增验证。结果显示与基因测序结果一致。

3.4.3 Notch通路相关lncRNA验证 选取差异表达较多的MALAT1、CARMN、LINC-PINT对测序结果进行实时荧光定量PCR验证。3条lncRNA在验证时发现,CARMN、LINC-PINT在RA组与NC组中差异无统计学意义(P > 0.05),MALAT1组间比较显示,RA组MALAT1较NC组降低,差异有统计学意义(P < 0.01)。lncRNA MALAT1得到了较好的验证。

4 讨 论

RA病因病机尚不明确,其高致残率引起了社会的广泛关注。大部分RA患者在确诊时全身多个关节己经出现破坏,失去了最佳治疗时期。因此,RA早期诊断显得尤为必要。

研究发现,lncRNA在肿瘤[7]、心脑血管[8]、自身免疫[9]等多种疾病中发挥着重要作用。目前研究认为,RA发病与机体的各种免疫细胞如单核细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞水平失衡有关。免疫细胞活化过程与lncRNA水平密切相关,lncRNA能够调控免疫细胞的分化、分泌、凋亡、增殖等多种生物功能[10-12]。

lncRNA在RA病理生理过程中发挥的作用越来越大。RA患者是否存在差异表达的lncRNA?本研究发现,RA组与NC组共有9158条差异表达的lncRNA,上调的有5682条,下调的有3476条,差异表达的mRNA共有7895条,说明RA体内存在差异表达的lncRNA。进一步通过差异表达高倍lncRNAs与mRNAs的分析发现,mRNA主要与免疫炎症反应、细胞转录调节、细胞代谢、骨髓白细胞活化、血小板细胞活化等功能有关。KEGG信号通路分析显示,差异表达的mRNA主要参与RA、细胞凋亡、氧化应激、Notch信号通路等方面。

lncRNA在RA免疫炎症、细胞凋亡、氧化應激和信号通路传导失衡等过程起到重要作用。RA中过表达的lncRNA HOTAIR能够抑制miR-138引起细胞增殖和炎症反应,调节lncRNA HOTAIR能够明显抑制NF-κB信号通路的活化,导致IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)下调,从而抑制免疫炎症反应[14]。研究证明,RA疾病的发展与CD4+T细胞的凋亡异常有关[15-16]。RA外周血中Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)mRNA相对表达降低,Bcl-2升高[17]。前期临床研究发现,RA患者外周血CD4+T细胞凋亡缺陷相关Bcl-2 mRNA与RA疾病密切相关[17-18],本研究通过高通量基因技术筛选RA患者外周血淋巴细胞中异常表达的lncRNAs,找出3个表达差异比较显著的lncRNA与RA外周血淋巴细胞凋亡相关。进一步观察发现,lncRNA ENST00000619282、ENST00000637683和ENST00000511703可能参与了RA细胞凋亡的过程,并通过验证结果与高通量基因测序结果一致。因此,lncRNA可能竞争性结合某些凋亡因子,调控细胞凋亡水平,促进CD4+T细胞凋亡逃逸,导致RA免疫炎症反应。RA氧化应激中过氧化导致一系列炎性细胞因子浸润、蛋白酶分泌增加、产生大量氧化产物[19]。而RA患者线粒体膜因氧化应激去极化的过程,有利于线粒体的内容物大量进入胞质,参与自身抗体的产生,成为炎症反应中的重要环节[20]。lncRNA在氧化应激中发挥着重要作用,参与广泛细胞过程的调节,lncRNA与细胞衰老、氧化应激相关疾病的发生和维持有关。lncRNA HOTAIR能够调节NF-κB信号通路,影响RA氧化应激和免疫炎症反应[21]。本研究观察与氧化应激密切相关的lncRNA HOTAIRM1、DANCR在RA患者单核细胞表达显著增高,可能参与了RA的发生,并通过QRT-PCR方法进行验证,结果与基因测序结果一致。Notch信号通路在RA发病中起重要作用,其过激活可导致RA滑膜炎症反应加重。本研究结果显示,lncRNA MALAT1参与RA发病过程,与PAN等[22]研究结果相似。lncRNA MALAT1可通过调节miRNA表达影响Notch通路,lnc-MALAT1募集pre-miR-155剪接因子至细胞核内基因转录位点,调控靶基因表达[23],从而抑制血管内皮细胞异常增殖、分化功能减弱。进一步激活Notch通路,从而导致RA滑膜炎症及骨质破坏。

綜上所述,本研究通过高通量基因测序技术发现了RA外周血淋巴细胞中存在差异表达的lncRNAs,但其中大部分lncRNA的生物功能尚不可知。今后笔者将继续深入研究RA凋亡、氧化应激、Notch信号通路相关lncRNA,并发掘与lncRNA相关的miRNA,研究两者之间的关系,以期为RA疾病的有效治疗提供新的依据和靶点。

5 参考文献

[1] ZHANG TP,ZHANG Q,WU J,et al.The expression levels of long noncoding RNAs lnc0640 and lnc5150 and its gene single-nucleotide polymorphisms in rheumatoid arthritis patients[J].J Cell Biochem,2018,119(12):10095-10106.

[2] ZHAO D,JIANG Z,WANG Z,et al.Retinoid interferon-induced mortality19(GRIM9)inhibits proliferation and invasion in rheumatoid arthitis fibroblast-like synoviocytes[J].Biomed Pharmacother,2018(98):719-725.

[3] WAN L,LIU J.Changes of CD4+CD25+ Regulatory T Cells,FoxP3 in Adjuvant Arthritis Rats with Damage of Pulmonary Function and Effects of Tripterygium Glycosides Tablet[J].Int J Rheumatol,2012(318):348450.

[4] 曾小峰,朱松林,谭爱春,等.我国类风湿关节炎疾病负担和生存质量研究的系统评价[J].中国循证医学杂志,2013,13(3):300-307.

[5] 夏燕,冯佳,陈安平,等.类风湿关节炎外周血lncRNA差异表达研究[J].中国免疫学杂志,2016,32(1):9-12.

[6] 袁敏,徐黎明,郑娟,等.lncRNA在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的异常表达[J].山东医药,2018,58(10):63-65.

[7] ZHAO Y,LIU Y,LIN L,et al.The lncRNA MACC1-AS1 promotes gastric cancer cell metabolic plasticity via AMPK/Lin28 mediated mRNA stability of MACC1[J].Mol Cancer,2018,17(1):69.

[8] LIANG H,PAN Z,ZHAO X,et al.LncRNA PFL contributes to cardiac fibrosis by acting as a competing endogenous RNA of let-7d[J].Theranostics,2018,8(4):1180-1194.

[9] HUANG W,THOMAS B,FLYNN RA,et al.Retraction Note:DDX5 and its associated lncRNA Rmrp modulate TH17 cell effector functions[J].Nature,2018,562(7725):150.

[10] 李有强,张云燕,陈茶,等.3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化[J].重庆医科大学学报,2018,43(1):117-121.

[11] 崔桂荣,李焱,贾振薇,等.LncRNA AK093987在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及其临床意义[J].肿瘤学杂志,2018,24(4):360-364.

[12] 邓桢,姚芳苡,叶建青,等.长链非编码RNA在脂多糖诱导人巨噬细胞炎症反应中的表达变化[J].中华危重病急救医学,2017,29(4):306-310.

[13] YANG KY,CHEN DL.Shikonin Inhibits Inflammatory Response in Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts via lncRNA-NR024118[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:631737.

[14] ZHANG HJ,WEI QF,WANG SJ,et al.LncRNA HOTAIR alleviates rheumatoid arthritis by targeting miR-138 and inactivating NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol,2017(50):283-290.

[15] LI N,MA T,HAN J,et al.Increased apoptosis induction in CD4+ CD25+ Foxp3+ T cells contributes to enhanced disease activity in patients with rheumatoid arthritis through IL-10 regulation[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(1):78-85.

[16] TOUBI E,KESSEL A,MAHMUDOV Z,et al.Increased Spontaneous Apoptosis of CD4+CD25+ T Cells in Patients with Active Rheumatoid Arthritis Is Reduced by Infliximab[J].Ann N Y Acad Sci,2010,1051(1):506-514.

[17] 曹永贺,刘健.类风湿关节炎患者细胞凋亡与临床指标相关性分析[J].中国中西医结合杂志,2016,36(1):35-39.

[18] 刘健,章平衡,黄旦,等.lncRNA在風湿病中的研究进展[J].风湿病与关节炎,2018,7(12):58-63.

[19] KUNDU S,GHOSH P,DATTA S,et al.Oxidative stress as a potential biomarker for determining disease activity in patients with rheumatoid arthritis[J].Free Radic Res,2012,46(12):1482-1489.

[20] STAVROPOULOS-KALINOGLOU A,DELI C,KITAS GD,et al.Muscle wasting in rheumatoid arthritis:The role of oxidative stress[J].World J Rheumatol,2014,4(3):44-53.

[21] ZHANG HJ,WEI QF,WANG SJ,et al.LncRNA HOTAIR alleviates rheumatoid arthritis by targeting miR-138 and inactivating NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol,2017(50):283-290.

[22] PAN F,ZHU L,LV H,et al.Quercetin promotes the apoptosis of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis by upregulating lncRNA MALAT1[J].Int J Mol Med,2016,38(5):1507-1514.

[23] WU J,ZHANG H,ZHENG Y,et al.The Long Noncoding RNA MALAT1 Induces Tolerogenic Dendritic Cells and Regulatory T Cells via miR155/Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3 Grabbing Nonintegrin/IL10 Axis[J].Front Immunol,2018,13(9):1847.

收稿日期:2018-12-15;修回日期:2018-12-31


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