ApDHAR基因的克隆与RT-qPCR 检测

徐 欣 周其明 张永君 张耀亭 刘中文 朱绪伟

(河南省蚕业科学研究院，郑州 450008)

脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)，是维生素C再生途径的还原酶，DHAR在谷胱甘肽(glutathione，GSH)的作用下，催化氧化态的抗坏血酸DHA重新还原成抗坏血酸(L-ascorbic acid，AsA)[1]。除了从番茄中克隆到2个DHAR基因外[2]，Chen等[3]在烟草和玉米中证明增加DHAR的表达，可以提高植物体内抗坏血酸的含量，还发现超量表达DHAR的转基因植株对臭氧的抗性增加[4]。在小鼠中的同源基因是未命名蛋白产物和谷胱甘肽S-转移酶，在家蚕中的已有研究认为此基因是 noppera-bo(nobo-Bm，GSTe7)，参与家蚕蜕皮激素的合成和幼虫的发育，当此基因缺失时会导致幼虫的生长发育抑制以及角质层为光滑的表现[5]。但是，DHAR作为维生素C代谢途径的关键酶，在柞蚕体内迄今为止没有相关研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 柞蚕品种

豫大一号，由河南省蚕业科学研究院繁育提供。

1.1.2 主要试剂

维生素C，粉剂，纯度99%，Sigma公司产品；苯基硫脲，粉剂，纯度97%，上海源叶生物科技有限公司产品；动物组织总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Tissue Kit)，FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(FastQuant RT Kit(with gDNase))，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖，GeneGreen核酸染料均为天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.3主要仪器 TGL16M高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司产品；PCR仪(9200型)，Applied Biosystems；UV2600紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司产品；1600凝胶成像仪，上海天能科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

利用果蝇基因组数据库(FlyBase)、家蚕基因数据库(Silkworm Genome Database)、NCBI等数据库，找到其他物种中DHAR的氨基酸序列，选择保守结构区域，结合 PCR 引物设计原则，用引物设计软件Primer Premier 5.0设计了ApDHAR基因特异引物，并选择 RT-qPCR 检测的内参基因柞蚕肌动蛋白基因(Antheraea pernyi Actin，ApA)为内参基因(正向引物：CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA；反向引物：CAAGAATGAGGGCTGGAAGAGA)，其退火温度为50°C，循环数为30。

1.2.2 柞蚕蛹总RNA的提取及cDNA的合成

用ddH2O把研钵、剪刀、镊子等用具洗干净，放在恒温干燥箱内，160 ℃烘烤4 h。RNA提取前，打开无菌室及洁净工作台内的紫外灯消毒半小时。使用动物组织总RNA提取试剂盒，按照其说明书方法从柞蚕蛹中提取总RNA，置于-80 ℃中保存备用。

按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书的步骤将RNA反转为cDNA，置于-20 ℃中保存备用。

1.2.3 PCR反应体系及条件确定

使用2×Taq PCR Mastermix进行PCR反应，经过对引物核苷酸序列的分析及不同退火温度(45 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、55 ℃)下PCR产物的电泳结果来确定ApDHAR基因扩增的最佳退火温度。

PCR反应的循环数也是一个必需的参数。先94 ℃预变性3 min，再按94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min为1循环，待定循环数(26、28、30、32、34和36)后，72 ℃继续延伸10 min。由此确定ApDHAR基因扩增的最佳循环数。

PCR反应体系：

2×Taq PCR Mastermix 12.5μL

Forward Primer，10μM 1μL

Reverse Primer，10μM 1μL

Template DNA 1μL

ddH2O to final Volume 25μL

1.2.4 电泳图片的获得

PCR产物在TAE电泳缓冲液中，以1.0%琼脂糖凝胶、120-150 V电泳25 min，经GeneGreen核酸染料染色后在Tanon-1600凝胶自动成像仪下观察拍照。

1.2.5 4龄24 h注射维生素C对ApDHAR基因相对表达量的影响

根据前期试验结果，维生素C注射剂量梯度为0 mg/g、0.01 mg/g、0.02 mg/g体重，4龄24 h柞蚕，在注射后0 h、1 h、6 h、12 h、24 h共5个时间点提取全蚕RNA，通过测定RNA的OD260/OD280结合琼脂糖变性凝胶电泳确定RNA的纯度及含量，将所有RNA样品均稀释到1 μg/μL，按照反转录试剂盒的说明书将RNA反转为cDNA，以各样品cDNA为模板进行PCR扩增，采用ApA做阳性对照，对ApDHAR基因作差异性表达分析。

基因的相对表达水平以其PCR产物电泳条带和ApA基因PCR产物电泳条带的积分光密度(Integrated Optical Density，IOD)比值表示。所有的实验均重复3次，试验数据采用SAS 9.0数据分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 反转录cDNA模板的检测

用ApA对提取的柞蚕蛹cDNA进行质量检测，电泳检测到一条大小468 bp的条带(图1)，证明可以进行后续试验。

图1 ApA基因cDNA的PCR产物电泳图

2.2 最佳退火温度和循环数的确定

对于ApDHAR基因在退火温度46～54 ℃之间每2 ℃为一个梯度，PCR产物均无非特异性条带，而且在50 ℃时电泳条带的光强度值最大(图2左)，因此扩增的最佳退火温度是50 ℃。

对于ApDHAR基因在24～32个循环之间每2个循环为一个梯度，PCR产物均无非特异性条带，而且在32个循环时电泳条带的光强度值最大(图2右)，因此最佳循环数为32个循环。

图2 不同退火温度和循环数PCR产物电泳图谱

图3 ApDHAR基因的PCR产物电泳图谱

2.3 ApDHAR基因的克隆与测序

根据引物最佳扩增条件，运用柞蚕蛹cDNA作为模板进行PCR检测，到一条大小约860 bp的条带(图3)，成功克隆到ApDHAR基因，然后送公司测序(测序结果需要进一步试验因此没有列出)。

2.4 注射维生素C后ApDHAR基因的表达量变化

有图4所示，在注射维生素C后1 h时，处理组表达量都比对照组降低，高剂量降低更明显，说明体外注射维生素C能抑制该基因表达；而且至24 h抑制效果持续存在，可能与该酶参与的代谢循环较慢有关。

3 小 结

经过多次引物设计，扩增到ApDHAR基因，在其他昆虫中为维生素C再生途径的还原酶，虽然本试验初步通过RT-qPCR 检测其功能，并发现体外注射维生素C能抑制该基因表达，但测序结果中其基因序列与其他基因比对结果并不理想，下一步需要运用RACE方法，扩增基因的全长，以期对基因进行较深入研究。

图4 4龄24 h注射维生素C对ApDHAR基因相对表达量的影响