甘氨酸对小鼠早期胚胎发育影响的剂量效应研究

周 鑫，豆昌凤，胡德港，宋延娜，王 荣，张 迪

（阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）

甘氨酸是体内最简单的氨基酸。人体或其他哺乳动物可以自身合成[1]。其不仅参与蛋白质的合成，也是嘌呤和S-腺苷甲硫氨酸等合成所必需的氨基酸[2]。此外，在氧化损伤修复[3]、免疫调节[4]等方面都发挥重要作用。细胞生长和增殖受到多种信号调节，研究表明甘氨酸及其受体（glycine receptor,GLR）是神经信号传导中重要的组成，在细胞凋亡[5]方面也发挥重要影响。它在胰岛素受体信号传导，蛋白质翻译，细胞周期进程和基因表达中承担重要作用[6-8]。在哺乳动物胚胎工程及人类辅助生殖中，早期胚胎的体外培养将影响到胚胎的发育潜能。研究表明，发育中胚胎的营养和能量需求变化与其生化和形态学变化相关，包括合子基因激活，桑葚胚致密化以及囊胚的形成和扩张[9]。

早期胚胎发育所处培养液中，氨基酸在胚胎植入前发育中发挥了多种功能，既可作为蛋白质合成的底物，也对ATP的产生[2，10]、嘌呤和嘧啶的合成[2]、甲基化[11]、维持细胞的氧化还原平衡[12]等也是重要的。有关氨基酸通过mTOR依赖途径调节小鼠滋养外胚层分化的研究发现，囊胚的形成需要有氨基酸的参与[13]。培养基的渗透压是哺乳动物胚胎发育的重要因素。甘氨酸在胚胎植入前发育中的一个重要作用就是其在高渗环境中维持细胞体积和细胞内渗透压[14]。例如在小鼠中，甘氨酸在细胞内累积至较高水平，并在2细胞阶段起到调节渗透的作用[15]。而对猪的早期胚胎研究显示，向等渗培养基中添加甘氨酸可以避免卵母细胞发育受到抑制，与低渗培养基相比，可提高囊胚形成率[16]。

因此，可以判定甘氨酸在胚胎发育中发挥着重要作用，但对于其发挥的作用与剂量间的关系还未见详细的研究。尤其是在甘氨酸的不同浓度剂量对早期胚胎中基因表达影响的研究还未见报道。本研究通过比较培养液中不同浓度甘氨酸对小鼠早期胚胎发育的影响，并通过定量PCR(polymerase chain reaction)测定相关候选基因的表达变化，试图发现甘氨酸对早期胚胎体外发育产生的影响及可能途径，为胚胎技术，临床辅助生殖提供必要的实验参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物为清洁级8周龄昆明白雌性小鼠，8～10周龄昆明白雄性小鼠。购自安徽医科大学实验动物中心；注射用孕马血清促性腺激素(pregnant mare timulationgonadotropin，PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)购自宁波第二激素厂；胚胎培养级水购自HyClone；生理盐水购自国药；RNase抑制剂购自TIANDZ；一步法定量试剂盒购自Takara；其他药品若无特殊说明，均购自Sigma。

1.2 主要仪器

倒置显微镜(德国 Leica，DMI3000B)，三气培养箱(美国Thermo，3141)，小型台式高速冷冻离心机(德国 eppendorf，5417R)，分析天平(梅特勒，XS205DU)，超净工作台(苏州净化，SW-CJ-2E)，药品恒温冷藏柜(SANYO，MDR-411FR)，定量PCR仪（ABI，StepOnePlus）。

1.3 主要试剂与培养液配制

小鼠输卵管培养液(HTF)，胚胎操作液(M2)，胚胎培养液(KSOM)按照文献配方配制[17]。

1.4 小鼠MII卵收集、体外受精及胚胎的体外培养

昆明白雌鼠，腹腔注射PMSG 5IU，48 h后腹腔注射HCG 5IU，12.5 h后处死，取MII卵置于HTF培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养1.5 h。取雄鼠附睾尾后放入1 mL已孵育过的HTF培养液中，撕开附睾尾，释放精子并观察精子活力，于37℃、5%CO2培养箱中使精子获能2 h；取50µL精子悬浮液加入到盛有卵丘团的HTF培养液中，轻轻晃动并将培养板放回37℃、5%CO2培养箱中4～6 h；用已孵育的MII操作液清洗卵子数次以去掉精子，观察并统计受精卵原核形成及第二极体外排情况，将受精卵移至含有不同浓度甘氨酸的KSOM培养液中继续培养，观测并记录胚胎在各发育时期的发育情况。

1.5 定量PCR

收集各组的囊胚到1.5 mL离心管中，每管5个，用5µL裂解液裂解，可-20℃冻存。用Takara公司一步法定量PCR试剂盒检测Ptafr、Ptgfr、Tacr3、Ednra 和 Uts2r。基因表达变化采用 2-△△Ct法进行相对定量。以Gapdh为内参基因。引物信息见表1。

定量PCR中的各参数按照标准流程设定，采用Takara公司的一步方法执行。即42℃5 min，95℃10 s反转录，然后 95℃5 s，60℃30 s，50次循环。结束时执行溶解曲线检测分析。每5～10枚囊胚用于一个PCR反应体系，重复三次。

1.6 统计分析

采用SPSS16.0对各阶段胚胎发育进行单因素方差分析，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甘氨酸对小鼠早期胚胎发育影响的剂量效应

为详细了解甘氨酸对胚胎发育影响的剂量效应，将体外受精来源的原核胚置于含有不同浓度甘氨酸的小鼠胚胎培养液（KSOM）中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。统计胚胎在各发育时期的发育状况（见表2）。观察胚胎在各发育时期的发育状况，其中囊胚阶段各组胚胎的状况见图1。

从表2的结果可以发现，当甘氨酸的浓度达到2.5µg·mL-1时，胚胎在各阶段的发育与正常组比较没有显著性改变，甚至略有促进。而当甘氨酸浓度达到5µg·mL-1及以上时，胚胎发育（囊胚形成率）开始受到明显抑制，当甘氨酸达到10µg·mL-1及以上时，囊胚的形成基本被完全抑制。各实验组胚胎都能较顺利地发育通过2-cell阶段，主要的发育受抑制期表现为2-cell后阶段。此外，随着甘氨酸浓度的升高，胚胎发育表现出明显的延迟现象，即发育的相应阶段所需时间明显延长。这一点在甘氨酸浓度为5µg·mL-1组尤为明显。当甘氨酸浓度达到10µg·mL-1，胚胎发育将被抑制到桑葚胚阶段，无法继续发育下去。

2.2 甘氨酸对胚胎发育相关基因表达的影响

为解甘氨酸对胚胎发育的影响在分子水平上的表现，本工作特别挑选了5个已知的在小鼠囊胚阶段具有关键作用的基因进行表达分析。这五个基因分别是Ptgfr、Ptafr、Ednr、Tacr3和Uts2r。

利用定量PCR方法，比较并分析了它们在来源于对照组及在 2.5 µg·mL-1和 5 µg·mL-1甘氨酸条件下发育形成囊胚中的表达。5个基因的表达改变情况见图2。

表1 5个基因引物序列

图1 不同甘氨酸浓度体外培养条件下小鼠囊胚观察图

表2 不同浓度甘氨酸对小鼠早期胚胎发育的影响

从图2可以看出，与对照组相比，Ptgfr的表达没有受到甘氨酸的明显影响，而另外4个基因的表达在甘氨酸存在的情况下都发生了改变。其中Tacr3和Uts2r在2.5µg·mL-1组中呈现下调表达，而在5µg·mL-1组中呈现上调表达。因此，变化趋势为伴随甘氨酸浓度的升高，二者的改变呈现为逆转趋势。这说明了体外培养液中适度的甘氨酸浓度与过量的甘氨酸浓度对Tacr3和Uts2r的表达具有不同的影响。对于Ptafr和Ednr，在甘氨酸不同浓度条件下的表达改变分别呈现出单向的上调和下调趋势。

3 讨论

甘氨酸在蛋白质代谢和信号传导等方面有着重要的作用。作为非必需氨基酸之一，动物体可以通过自身合成满足生长发育的需要。大多数动物成熟卵母细胞都含有一定的内源性甘氨酸，可以满足胚胎早期发育的需要。在甘氨酸对猪卵母细胞孤雌发育影响的研究中指出，甘氨酸对胚胎发育的影响与具有发育阶段相关性[16]。这提示在体外培养小鼠或人早期胚胎的培养液中补充甘氨酸可能会促进胚胎的发育。但同时应该注意到，胚胎培养基中添加的甘氨酸浓度不同于输卵管和子宫液中的浓度，超过生理浓度的甘氨酸可能会改善胚胎植入前的发育，但也可能抑制植入前及影响胚胎植入和植入后的发育[18]。在本研究中，添加较低浓度的甘氨酸（2.5µg·mL-1）不但不会抑制胚胎的早期发育，甚至略有促进。但继续提高甘氨酸浓度，则抑制效果逐渐加强。这很好地验证了上面提出的假设。因此，为了保证胎儿的正常发育，培养液中添加甘氨酸时需慎重选择补充浓度。本研究为在哺乳动物胚胎体外培养时，选择使用更加合理有效的培养液组成提供了一定的实验参考数据。

甘氨酸浓度变化也会影响到胚胎基因的表达。本工作中，来自定量PCR的研究结果也证实了这一点。胚胎发育相关基因Ptgfr、Ptafr、Ednr、Tacr3和Uts2r。在囊胚形成和胚胎植入过程中发挥着重要功能。研究指出，PTGFR（前列腺素F2α受体）是识别子宫内膜妊娠的胚胎信号受体[19]，抑制其合成会导致物种在植入前终止妊娠。EDNRA(内皮素受体A型)是Endothelin的G蛋白偶联受体，可通过自分泌或旁分泌对胚胎发生和早期胚胎发育起到调控作用[20]。TACR3(速激肽受体3)是人类正常生殖发育和功能的关键调节因子，在调节促性腺激素释放激素的释放中发挥重要作用，其在生殖内分泌调控中的作用受到越来越多的重视[21]。PTAFR是血小板激活因子(PAF)受体，在人类排卵、受精、着床等生殖过程中发挥重要作用。较高水平PAF可以增加妊娠率[22]。UTS2R(尾加压素Ⅱ受体)在血管收缩方面发挥作用，具有增加迁移，粘附和体外血管生成能力[23]。5个基因中的Tacr3和Uts2r的表达改变与甘氨酸浓度对胚胎发育的影响表现出很好的相关性，证明了在基因表达水平上，甘氨酸对胚胎发育影响的存在。尽管对甘氨酸调节这些基因表达的途径与机制还不清楚，但可以假定它是通过包括渗透压、细胞信号传导和表观遗传修饰等多种途径实现的。今后的工作应通过高通量组学分析，系统性地研究甘氨酸对胚胎发育的影响的主要靶点和可能途径，来揭示其在胚胎发育中的角色。

在现有的胚胎发育和辅助生殖工作中，使用的培养液有商业化产品和实验室自配培养液。其中关于氨基酸的种类和用量既无统一规定，也没有用量的理论依据。这导致在胚胎发育的质量控制方面无法做到统一。这些因素都造成了对生殖发育领域的研究和临床生殖治疗的阻碍。本工作期望，通过初步分析甘氨酸的剂量变化对胚胎发育的影响，提示对甘氨酸等重要物质在胚胎发育过程的作用展开研究的必要性。更重要的是，对在临床辅助生殖中使用到的各种培养液成分建立统一的科学标准提供必要的依据。

图2 不同浓度甘氨酸对5个基因在囊胚中表达的影响

4 小结

本文通过改变胚胎培养液中的甘氨酸浓度，分析了不同浓度的甘氨酸对小鼠早期胚胎发育的影响。研究结果表明，甘氨酸对胚胎发育的影响存在一个临界浓度，过高浓度的甘氨酸将显著抑制胚胎的发育，并且胚胎发育基因的表达也呈现出相关的改变。这些结果都表明甘氨酸是一个影响胚胎发育的重要因素。