羟基红花黄色素A逆转卵巢癌耐药细胞株A2780/DDP的作用及机制

沈晓燕 朱磊 张佳颖 梁若笳⋆

卵巢癌是具侵袭性妇科肿瘤，死亡率居妇科肿瘤的首位。在细胞减灭术的基础上，以顺铂（DDP）为基础的联合化疗方案已成为卵巢癌的常规治疗方案，然而，对DDP的肿瘤多药耐药（MDR）是导致卵巢癌化疗失败、死亡率高的主要原因。研究发现卵巢癌细胞耐药性的发展与上皮间质转化（EMT）密切相关［1］。中药红花中水溶性成分羟基红花黄色素A（HSYA），具有诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤转移、抗凝、抗炎镇痛等多种作用。本文探讨HSYA对人卵巢癌A2780/DDP细胞株顺铂耐药性的逆转作用及对MAPK/ERK信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人卵巢癌敏感株A2780及其DDP耐药株A2780/DDP，中科院上海细胞库。

1.2 试剂与仪器 （1）主要试剂：HSYA（江苏江阴天江药业有限公司，批号146087-19-6，纯度＞98%）；DDP（德州德药制药有限公司，批号37020523）；1640培养基：GIBCO Company；胎牛血清：Hyclone Company；胰酶：GIBCO Company；Erk1/2，P-Erk1/2和GAPDH抑制剂（美国Sigma Chemical公司）；ECL Plu试剂盒（Bio-Rad 公司）；Tris缓冲液（SIGMA公司）。（2）主要仪器：二氧化碳培养箱：3111 型，Thermo 公司；倒置显微镜：ECLIPSE Ti-S型，Nikon公司；细胞培养瓶、细胞培养皿：Fisher Scientific 公司；NovoCyte 流式细胞仪，艾森生物（ACEA）；RTCA仪器：xCELLigence 细胞功能分析仪DP系统；艾森生物（ACEA）；微量加样器：RAININ公司；涡旋振荡仪：Bio-Rad 公司；台式高速冷冻离心机：ST16R，Thermo Fisher 公司；组织样本研磨器：Fastprep-24 5G，MP；酶标仪：1681130-4B，Bio-Rad 公司；电泳系统：Mini-Proten Tetra System，Bio-Rad 公司；凝胶成像仪：ChemiDocTM Touch Imaging System，Bio-Rad 公司。

1.2 方法 （1）细胞培养：将A2780用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素的1640培养基，培养于37℃，CO2浓度为5%的CO2培养箱温育。A2780/DDP用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素和2μg/ml DDP的1640培养基，培养于37℃，CO2浓度为5%的CO2培养箱温育。（2）筛选DDP浓度：取对数生长期A2780和A2780/DDP细胞，分别设立空白对照组，接种于96孔板中，每个实验组设6个平行孔，每孔100μl，含 1×104个细胞。培养24h后，分别加入不同浓度DDP（4μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、等体积的培养基），培养76h，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值（A）。细胞的存活率（%）=（AA2780/顺铂组/A模型组）×100%。测得A2780/DDP细胞50%存活率的DDP浓度为25μg/ml，用于后续实验。（3）实验分组：取对数生长期A2780和A2780/DDP细胞，分为正常组（A2780细胞）和耐药组（A2780/DDP细胞），其中耐药组又分成顺铂组、HSYA组、联合组和对照组，分别接种于96孔板中培养。（4）检测A2780/DDP细胞存活率：取顺铂组、联合组及对照组细胞，顺铂组中加入25μg/ml DDP，联合组加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，对照组加入等体积培养基。每隔12h，使用酶联免疫检测仪测量各组的吸光值（A）。细胞的存活率（%）=（AA2780/顺铂组/A模型组）×100%。（5）检测A2780/DDP细胞迁移能力：在E-Plate检测板中加入50μl培养基并测定背景阻抗值。将顺铂组、联合组及对照组细胞浓度调整为5×104/ml，取100μl的细胞悬浮液加入至E-Plate检测板中，室温下放置30min后，每间隔15min使用实时细胞分析技术（RTCA）进行实时动态的细胞指数检测。检测24h后，顺铂组培养孔中加入25μg/ml DDP，联合组加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，对照组加入等体积培养基。60h内每隔15min检测1次以观察长期疗效。（6）检测A2780/DDP细胞凋亡率：取顺铂组、联合组及对照组细胞接种于6孔板，每组设3个复孔。顺铂组加入25μg/ml DDP，联合组加入25μg/ml DDP和1mg/ml HSYA，对照组加入等体积培养基。培养48h，胰酶消化后收集细胞，PBS洗涤1次，1000r/min离心5min。加入100μl Annexin V-PE结合液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min后，1000r/min离心5min，用PBS洗涤沉淀细胞。加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。24h后使用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡率。（7）Western blot检测：取正常组、耐药组中的对照组和HSYA组细胞，接种于6孔板中，每组设3个复孔。正常组和对照组加入等体积培养基，HSYA组加入1mg/ml HSYA。培养48h，PBS洗2次，胰酶消化，加入10ml 培养液，制备成细胞悬液，多次离心弃上清液后，加入200μl细胞裂解液，裂解蛋白后离心。使用考马斯亮蓝染料法测定蛋白浓度。用SDS-PAGE缓冲液稀释等量蛋白，再进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，分离的蛋白带电转至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶室温封闭1h，分别用Erk1/2、P-Erk1/2和Gapdh单克隆抗体孵育4℃过夜。用Tris缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h，Tris缓冲液洗膜，加入ECL，混匀后加在PVDF膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。使用ImageJ 软件分析各条带光密度。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料均以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSYA对A2780/DDP细胞存活率的影响 当浓度为25μg/ml的DDP联合HSYA作用24h后，联合组的A2780/DDP细胞存活率明显低于单纯的顺铂组（P＜0.01），且随着时间的增加差异增大；作用48h后，联合组A2780/DDP细胞存活率＜50%（见图1）。

图1 A2780/DDP细胞随时间变化的存活率

2.2 HSYA对A2780/DDP细胞迁移能力的影响 在实验的前30h，顺铂组、联合组及对照组的A2780/DDP细胞的迁移能力随着时间的增加而增加；作用30h后，模型组细胞迁移能力仍在增加，而顺铂组和联合组A2780/DDP细胞的迁移能力明显下降，且联合组的下降趋势较顺铂组更显著（P＜0.01）（见图2）。

2.3 HSYA对A2780/DDP细胞凋亡率的影响 对照组A2780/DDP细胞早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率分别为0.36%和0.09%，总凋亡率为0.47%；顺铂组A2780/DDP细胞早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率分别为7.92%和6.33%，总凋亡率为14.25%；联合组A2780/DDP细胞早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率分别为9.36%和15.66%，总凋亡率为25.02。与对照组和顺铂组相比，联合组A2780/DDP细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）。

图2 A2780/DDP细胞随时间变化的细胞迁移能力

2.4 HSYA对MAPK/ERK的影响 Western blot结果提示，与正常组相比，对照组Erk1/2、p-Erk1/2蛋白含量明显增加（P＜0.05），HSYA组则无明显差异。经HSYA干预后，A2780/DDP细胞中Erk1/2、p-Erk1/2蛋白含量较对照组显著下降（P＜0.05）（见图3）。

2.5 HSYA对EMT的影响 Western blot结果提示，与正常组比较，对照组E-cadherinl表达减少，Vimentin、Snail和 Twist蛋白含量明显增加（P＜0.05）。与对照组比较，HSYA组E-cadherinl 表达增加，Vimentin、Snail和Twist表达显著下降（P＜0.05）（见图4）。

图3 各组细胞Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达情况

图4 各组细胞EMT过程中E-cadherinl、Vimentin、Snail和Twist蛋白表达情况

3 讨论

卵巢癌在女性癌症中排名第3位，多发生在围绝经期妇女中，近年来发病年龄趋于年轻化［2］。由于卵巢癌早期症状隐匿和缺乏有效的诊断方法，60%～70%的卵巢癌患者在确诊时已处于Ⅲ～Ⅳ期或腹部转移，因此其5年生存率＜40%。术后以铂类（顺铂或卡铂）为基础的联合化疗是目前的标准治疗。尽管初始反应率一致，最初铂类敏感的患者最终易产生化学抗性，从而导致肿瘤复发或进展。因此，逆转卵巢癌的化疗耐药是延长卵巢癌生存期的核心问题。

卵巢癌对顺铂耐药的分子机制尚不明确，越来越多研究表明，卵巢癌耐药的发生与MAPK/ERK信号调控EMT状态密切有关。MAPK是细胞内主要的信号转导系统之一，也是调控EMT的主要信号途径。经典的MAPK家族介导的信号传导途径包括细胞外信号调节激酶（ERK）、p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶和其他亚家族［3］，近年来研究证实MAPK/ERK通路在肿瘤耐药及转移中起重要作用。Xu W等发现活化T细胞核因子（NFATC1）可通过激活ERK1/2/p38/MAPK信号通路促进卵巢癌细胞的生长［4］。Chang MC等［5］发现间皮素（MSLN）可通过MAPK/ERK和JNK信号转导途径通过MMP-7表达增强卵巢癌侵袭。Hou L等［6］研究证实，Erk的磷酸化和EMT过程的激活有助于增强SKOV-3/DDP对顺铂的抗性，使用MEK抑制剂PD98059可显著抑制SKOV-3/DDP的ERK途径和EMT过程，抑制细胞增殖，减少迁移面积。

本实验通过MTT比色法、RTCA法和流式细胞检测发现DDP与HSYA联用可以降低A2780/DDP细胞的存活率、抑制A2780/DDP细胞的迁移能力、提高A2780/DDP细胞的凋亡率，从而验证DDP联合HSYA能够增加A2780/DDP细胞对DDP的敏感性。Western blott则进一步表明，对照组Erk1/2、p-Erk1/2表达增加，E-cadherinl表达减少，Vimentin、Snail和Twist蛋白含量增加，证实卵巢癌顺铂耐药与体内MEPK/ERK信号通路异常促进EMT有关。而经HSYA用药后，A2780/DDP细胞的Erk1/2、p-Erk1/2显著下降；与之相反，EMT过程的关键性因子Vimentin、Snail和Twist表达均减少。基于以上实验结果，作者认为，HSYA可以有效增强卵巢癌细胞对DDP的敏感性，其机制是通过减少Erk1/2、p-Erk1/2表达，干预MAPK/ERK信号通路，从而抑制EMT的过程，实现逆转顺铂耐药。