2型糖尿病患者血浆miR-144水平与吸烟状况的相关性研究*

刘春兴，高永辉，汤在祥

(1.华东疗养院，江苏无锡 214065；2.苏州大学医学部公共卫生学院，江苏苏州 215001)

糖尿病是一种全球范围内高发的慢性代谢性疾病，目前我国约有1.14亿糖尿病患者，其中90%以上是2型糖尿病(T2DM)。吸烟是导致糖尿病心血管并发症死亡的重要原因之一[1]，但其机制尚不明确。

微小核糖核酸(miRNA)能通过结合靶基因mRNA 3’末端非翻译区来调节基因的表达，可作为分子标志物，辅助多种疾病诊断。有研究表明，微小核糖核酸-144(miR-144)与T2DM胰岛素抵抗相关，能够通过抑制胰岛素受体底物1的表达来影响胰岛素信号通路[2]。本研究通过检测血浆miR-144水平，比较不同吸烟指数下的T2DM患者血浆miR-144水平，探讨吸烟对糖尿病患者血浆miR-144水平的影响，为进一步研究吸烟对糖尿病影响的机制提供依据。

1材料与方法

1.1 研究对象 在2018年1～6月到华东疗养院体检的人群中选择T2DM患者70例为研究对象，男性59人，女性11人；其中不吸烟组31例，戒烟组13例，吸烟组26例；纳入标准：T2DM符合WHO 1999年诊断标准；排除标准：1型糖尿病患者，糖尿病急性并发症、感染及手术等应激情况；严重肝肾功能不全和其他系统疾病。

1.2 研究方法 入选对象均由专业人员进行调查询问吸烟状况，包括开始吸烟年龄、吸烟年限、平均每日吸烟支数及戒烟年限，计算吸烟指数，计算公式为：吸烟指数=平均每日吸烟支数×吸烟年数。

研究对象空腹8～12 h，于次日清晨采集静脉血，其中5 ml于常规血清管中，2 ml于EDTA抗凝管中，颠倒混匀8次，于1 h内送检验科，20℃ 2 000 r/min离心10 min分离血浆和血清。使用贝克曼全自动生化仪AU5400检测血清葡萄糖(GLU)、日本东曹G8全自动血红蛋白检测仪检测血浆糖化血红蛋白(HbA1c)。

采用定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测血浆miR-144：操作如下：使用宝生物的RNAiso PLUS试剂来提取血浆RNA。取100 μl 血浆，加入1 ml RNAiso PLUS试剂，涡旋混匀后加入200 μl氯仿再次涡旋混匀，室温放置5 min后12 000 g离心15 min，取上清加入等体积异丙醇，-20℃放置2 h后12 000 g 4℃离心15 min，去上清，以1 ml 75 ml/dl乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀后以10 μl DEPC水溶解沉淀。

采用吉玛探针法Hairpin-it miRNAs qRT-PCR定量试剂盒对RNA逆转录，同时取试剂盒中的标准品溶解后稀释至10-4，10-5，10-6，10-7和10-8nmol/L后逆转录。使用QPCR方法检测各浓度对应的Ct值，以浓度对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本血浆中miR-144浓度。

2结果

2.1 不同吸烟组别人口学基线比较 见表1。三组人群中年龄、饮酒史，BMI，GLU，HbA1c等结果两两比较，差异均无统计学意义(F=0.184，P=0.791；χ2=0.321，P=0.611；F=0.348，P=0.849；F=0.266，P=0.914；F=0.005，P=0.171)，仅性别分布存在差异，在戒烟组和吸烟组女性人数均为0。

表1 不同吸烟组别一般资料比较

2.2 不同吸烟组别血浆miR-144水平的比较 见图1。不吸烟组，戒烟组和吸烟组血浆miR-144水平分别为1.15×10-5±1.18×10-5，1.5×10-5±2.2×10-5，和2.14×10-5±1.93×10-5nmol/L。吸烟组高于不吸烟组，差异有统计学意义(t=5.632，P=0.0210)，但与戒烟组比较差异无统计学意义(t=0.872 4，P=0.388 3)；戒烟组血浆miR-144水平与不吸烟组差异无统计学意义(t=1.179，P=0.244 1)。

图1 不同吸烟组别血浆miR-144水平比较

2.3 吸烟指数和血浆miR-144水平的相关性分析 采用公式计算吸烟指数，并与血浆miR-144水平进行相关性分析，结果(图2)表明吸烟指数和血浆miR-144水平呈紧密相关，相关系数r=0.814，差异具有统计学意义(P<0.001)。

图2 血浆miR-144水平与吸烟指数的线性相关性

3讨论MiRNA是一类大约由22个核苷酸组成的非编码RNA，作为近年来研究热点，miRNA在转录后水平和翻译水平调控靶基因表达，从而参与调控生长、发育、疾病发生发展等多项生理功能。许多针对miRNA的研究主要集中在肿瘤的诊断及预后[3]。在肿瘤发生的机制方面，miR-144能够通过调节E2F8[4]，ARID1A[5]和ZFX[6]等基因调控肿瘤细胞增殖、迁移和分化。除了肿瘤相关研究，miR-144能够通过抑制ABCA1蛋白的表达，调控胆固醇代谢及血浆高密度脂蛋白水平[7]；miR-144缺失会上调Rac-1介导的氧化应激信号来限制缺血心肌保护[8]。在糖尿病方面，miR-144能够通过抑制胰岛素受体底物1表达，来破坏胰岛素信号通路。

流行病学研究表明，吸烟是促进T2DM发生的重要危险因素[9]，但机制并不明确，是否通过升高miR-144造成影响还属未知。本研究采用绝对定量的方法检测血浆miR-144水平，发现吸烟指数与T2DM患者血浆miR-144水平呈正相关。同时本研究也存在一定的局限性，女性均明显少于男性；吸烟组的样本数相对较少，且存在部分戒烟超过5年的样本，这可能与近年来国家禁烟宣传与人民健康意识的提高有关。

综上所述，吸烟导致T2DM患者血浆miR-144水平上升，抑制胰岛素受体底物1表达，会导致胰岛素信号通路受损，从而引起胰岛素抵抗。因此控制吸烟对T2DM的防治有着至关重要的意义。