渝东北地区胎儿染色体非整倍体疾病的NITP分析*

孟凡萍，郝 坡

(1.重庆三峡中心医院检验科基因检测中心，重庆 404000； 2.重庆三峡医药高等专科学校医学技术学院，重庆 404020)

研究发现孕妇外周血中存在着胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，c-ffDNA)，主要源自胎盘滋养层细胞，无创产前基因检测(noninvasive prenatal genetic testing，NIPT)是一种新兴的无创产前检测方法，该法就是基于检测母体血浆，c-ffDNA，通过高通量测序技术对母体外周血中的c-ffDNA进行“非侵入性”产前检测，较血清学检查、超声筛查以及现有创伤等产前诊断方法，更具简便、快速、无创、可靠、易接受等特点，开辟了产前检查的新篇章，对现有的产前筛查、产前诊断体系进行了很好的补充[1～3]，可根据NIPT的检测结果对胎儿染色体非整倍体异常风险情况进行综合评估[4]。孕妇血中的c-ffDNA的检测与诊断中出现的染色体异常疾病有三种：21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征[5]。

本课题通过对渝东北地区2 784例12～24周孕妇采用高通量全基因测序，研究渝东北地区胎儿染色体21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征的发病率和年龄分布。

1材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年7月～2018年5月在重庆三峡中心医院基因检测中心行NIPT检测的2 784例12～24周孕妇外周血10 ml。

1.2 试剂和仪器 胎儿染色体非整倍体21三体、18三体、13三体检测试剂盒(半导体测序法全套试剂(文库构建试剂盒Ion Plus Fragment Library Kit，模板制备试剂盒Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit，测序试剂盒Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit，芯片Ion PITM Chip)由中山大学达安基因股份有限公司分装提供，乳液PCR仪(ion one touch2)、ion one touch ES，DNA荧光定量仪(Qbit3.0 fluorometer)由美国LIFE公司提供，基因测序仪DA8600由达安基因股份有限公司提供，PCR扩增仪购自杭州安杰思生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胎儿游离DNA的提取：将2 784例12～24周孕妇静脉血10 ml分别于4℃ 3 000 r/min,15 min及13 000 r/min,10min两次离心并分离血浆后，磁珠法提取游离DNA，存于-80℃。

1.3.2 文库构建扩增：将DNA片段末端补平后，再与特异性接头和P1接头连接，PCR扩增DNA片段。PCR扩增条件：72℃20 min，98℃2 min，(98℃15 s，62℃15 s，70℃1 min)10个cycle，70℃5 min，4℃ hold。纯化后将产物存于-80℃。

1.3.3 模板制备及上机测序：将文库用Qbit3.0 fluorometer定量，每15份样本为一批次，稀释终浓度为100 pmol/L混样后取适量与模板载体一同进行乳液PCR。在ion one touch ES上将乳液PCR产物富集，与测序质控模板、测序引物一同退火，加入到预处理后的测序芯片中上机测序。测序操作按照DA8600基因测序仪操作规程进行。

1.3.4 胎儿染色体信息分析：利用美国life公司二代测序平台及生物信息分析技术，对2016年7月～2018年5月在重庆三峡中心医院基因检测中心行NIPT检测的2 784例12～24周的孕妇进行分析，对NIPT结果显示为高风险的孕妇实施羊膜腔穿刺及胎儿染色体核型分析，对NIPT结果显示为低风险的孕妇进行电话随访至出生后。

1.4 统计学分析 采用卡方检验对数据进行统计分析。

2结果

2.1 孕妇患染色体非整倍体疾病高风险阳性率 见表1。行NIPT检测的2 784例孕妇，高风险20例，其中21-三体高风险12例，18-三体高风险3例，13-三体高风险5例，阳性检出率为0.72%(20/2 784)。≥40岁孕妇患染色体非整倍体疾病高风险的阳性率为2.97%，30～39岁为0.75%，<30岁为0.54%。

表1 渝东北地区孕妇NIPT高风险年龄分布

2.2 孕妇羊膜腔穿刺液细胞染色体核型分析 经检测，染色体非整倍体疾病为高风险的孕妇有20例，其中有2例孕妇未做羊膜腔穿刺分析，而直接进行引产终止妊娠，其余18例孕妇行羊膜腔穿刺液细胞染色体核型分析，发现21-三体高风险有11例，18-三体高风险有2例，13-三体高风险有4例。把NIPT检测后的结果与金标准方法--羊膜腔穿刺液细胞染色体核型分析技术检测后的结果进行比较，发现21-三体和18-三体细胞染色体非整倍体异常高风险结果符合率为100%(11/11，2/2)，而13-三体细胞染色体非整倍体异常高风险结果符合率为80.00%(4/5)，其中1例为假阳性结果，假阳性率为20.00%(1/5) 。故NIPT诊断胎儿染色体非整倍体疾病的诊断敏感度为100.00%(2 784/2 784)，诊断特异度为94.44%(17/18)，假阳性率为0.03%(1/2 784)，假阴性率为0.00%(0/0)。

3讨论1997年，香港中文大学卢煜明教授在怀有男性胎儿的孕妇外周血中扩增到了Y染色体的基因片段，因正常女性体内不含有Y染色体，从而说明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，经进一步检测发现，c-ffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，从此开启了孕妇产前检测的新思路，这就是NIPT技术的发现过程[6]。NIPT技术主要有两类：一类是采用高通量全基因测序，一类是采用靶向区域测序。NIPT技术主要适用于如下疾病的检测，如唐氏综合征(21-三体综合征)、爱德华氏综合征(18-三体综合征)和帕陶氏综合征(13-三体综合征)。目前，这些染色体疾病尚无有效的治疗方法，唯有通过早期的产前诊断来早发现，而传统的血清学方法因假阳性率高、侵入性检查有一定风险、孕妇难以接受等缺点不能很好开展相关检测，而NIPT技术针对这三大染色体非整倍体疾病的检测准确率高达99%以上，远高于血清学筛查，且假阳性率和假阴性率更低[7-10]，故可作为当前产前检测胎儿染色体异常的最佳手段。

NIPT技术是基于母体外周血中的c-ffDNA的检测，其含量与孕周密切相关，据了解，c-ffDNA最早4周便可检出，7周建立胎盘循环后c-ffDNA含量则以一定的比例稳步增加。NIPT的检测精度与c-ffDNA含量的多少有关，当c-ffDNA含量低于4%时，NIPT可能检不出或出现假阴性结果[11-12]，所以NIPT技术适用时间范围为(12+0～26+6)周，最佳检测时间范围为(12+0～22+6)周，如果从技术层面上讲，NIPT检测孕周并无上限，26+6孕周限制的原因是考虑到如果NIPT检测出现阳性结果，那么后续会留出合适的时间来进一步确诊。

本研究显示，渝东北地区胎儿染色体非整倍体疾病的阳性率为0.72%(20/2 784)，年龄分布为≥40岁孕妇为2.97%，30～39岁为0.75%，<30岁为0.54%。NIPT诊断胎儿染色体非整倍体疾病的敏感度为100.00%(2 784/2 784)，总特异度为94.44%(17/18)，总假阳性率为0.03%(1/2 784)，假阴性率为0.00%(0/0)。渝东北地区NIPT胎儿染色体非整倍体疾病的阳性检出率为0.72%，以21-三体检出为主，占61%，40岁高龄孕妇NIPT阳性率较其他年龄组明显升高，达2.97%。

高通量基因组测序平台及生物信息分析技术具有很高的敏感度和特异度，NIPT可提高产前诊断效率，其敏感度、准确度与羊膜腔穿刺分析技术具有高度的一致性，在快捷、安全、方便、患者易于接受的前提下，能减少患儿的出生，达到优生优育，具有较高的临床和社会价值。