高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中20种抗生素药物含量的方法研究

杨 娜 ，叶磊海 ，叶佳明 ，裘钧陶 ，应寒松 ，何 斌 ，钟世欢 ，詹越城

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。抗菌药主要分为八大类，其中β-内酰胺类包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、含酶抑制剂的β-内酰胺类、单环酰胺类等；以及氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、叶酸途径抑制剂类、氯霉素；糖肽类包括万古霉素和替考拉宁、大环内酯类。

我国卫生部颁布的《化妆品卫生规范》明确规定[1]，化妆品中禁止使用抗生素类物质，但不少商家为了追求利益，违规添加各种违禁物质，给人们的日常生活带来严重的危害。化妆品中添加的抗生素包括喹诺酮类、四环素类、咪唑类、硝基咪唑类等，当这类抗生素违规添加到化妆品中，散布于人体皮肤表面，人体长期接触含抗生素成分的化妆品后，会逐渐破坏皮肤表面的正常菌群，导致皮疹、速发性过敏等不良反应，有些还会引起贫血、胃肠道反应等。人们可能会由于使用了违法添加成分的化妆品，导致对抗生素类药物产生耐药性，给日后人类疾病的治疗带来困难[2-3]。

目前，检测化妆品中抗菌药物主要依据《化妆品卫生规范》[1]，其中每一类药物的前处理过程都不一样，不能满足快速检测的要求；并且检测此类药物的主要方法是高效液相色谱法[4-7]和液相色谱-质谱联用法2种[8-11]。高效液相色谱法能检测到的药物种类有限，且分析时间长、检测效率低、消耗成本高、达不到高通量检测要求，同时也由于化妆品成分复杂，色谱杂峰多，定性困难。而随着HPLC-MS应用日益广泛，液相色谱-串联质谱法由于速度快、灵敏度高、定性准确、高通量等优点已成为化妆品中禁限用物质检测的首选方法。

因此，试验旨在建立同时检测化妆品中多种抗菌类药物（包括喹诺酮类、四环素类和咪唑类）含量的高效液相色谱-串联质谱检测方法。结果表明，该方法简便、快速、准确，已应用于化妆品的检测，可以满足化妆品质量监管的需要。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯，美国TEDIA公司提供；氯化钠，杭州化学试剂有限公司提供；除非另有说明，所有试剂均为分析纯；水为GB/T 6682规定的一级水。

8种喹诺酮类标准品：恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、氟罗沙星、双氟沙星，6种四环素类标准品：四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素，6种咪唑类标准品：克霉唑、酮康唑、氟康唑、咪康唑、萘替芬、联苯苄唑，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

AB Sciex型高效液相色谱仪（配备二元梯度泵，自动进样器，柱温箱等，USA）；AB Triple Quad 4500型LC-MS/MS配有电喷雾（ESI） 离子源（USA）；TGL-16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；AR2140型电子分析天平，奥豪斯仪器常州有限公司产品；SQP型电子分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司产品；Milli-Q型纯水仪，美国Millpore公司产品；IKA MS3 basic型涡旋混合器、KH-500B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司产品。

1.2 溶液的配制

分别准确称取喹诺酮类、四环素类和咪唑类标准品0.025 g，各置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，将20种标准品分别配制成500 μg/mL质量浓度的标准储备液，于避光处冷藏保存；使用时用甲醇稀释成适当质量浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.3 样品制备

准确称取样品约0.5 g（精确至0.001 g），置于50 mL具塞比色管中，加入饱和氯化钠溶液1 mL，涡旋30 s，加入甲醇1 mL，涡旋30 s，再加入甲醇20 mL，涡旋30 s，超声提取30 min，涡旋30 s，加入甲醇定容至刻度，涡旋1 min，以转速4 000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测备用溶液。

1.4 分析条件

色谱条件：Agilent EC-C18（Poroshell 120） 型色谱柱，2.7 μm，3.0 mm×50 mm；流速0.3 mL/min；柱温40℃；进样量2 μL；流动相：A 0.2%甲酸水溶液，B乙腈；流动相梯度洗脱：0～1 min，10%B；1～10 min， 10% ～90%B； 10～11 min， 90%B；11～11.2 min，90%～10%B；11.2～15 min，10%B。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子多反应（MRM） 监测模式；气帘气压力30 psi，离子化电压5 500 V，雾化温度600℃，碰撞气7，雾化气和辅助气都是55 psi。

20种抗生素的质谱优化条件见表1。

表1 20种抗生素的质谱优化条件

续表1

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

质谱条件的优化是直接采用针泵恒流进样方式，稀释成0.5～1.0 μg/mL的标准溶液进入离子源，进行一级四级杆全扫描找到目标化合物母离子并确定母离子的质荷比（m/z）；第二步手动调节碰撞能量（CE）用来找到合适的子离子作为定性离子和定量离子，并确定子离子的质荷比（m/z）；第三步在多反应监测模式（MRM） 下优化各个子离子的去簇电压（DP）、碰撞能量（CE） 和碰撞池出口电压（CXP）。然后再优化离子源参数，采用三通进样方式，逐个优化气帘气压力、离子化电压、雾化温度、雾化气和辅助气参数，已确定最佳的质谱条件。具体参数详见表1。

2.2 色谱条件的优化

分别以乙腈、甲醇、0.1%甲酸水和0.2%甲酸水以不同比例组合为流动相，结果表明，采用0.2%甲酸水-乙腈分离效果较好、灵敏度更佳。分别考查了柱温、流速对色谱分离效果的影响，最终确定分析柱温40℃，流速0.3 mL/min。同时考查了洗脱条件对峰形和分离效果的影响，确定了最终的梯度洗脱条件。

2.3 样品提取方法的条件

根据《化妆品卫生规范》和相关文献，该方法比对了甲醇和乙腈作为提取溶剂的提取效果，最终选定甲醇为提取溶剂。

2.4 线性关系和检出限的考查

在确定的色谱和质谱条件下，对20种抗生素药物进行测定。用空白基质配置标准工作曲线，分别以质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线得到线性方程，通过向阴性样品中添加目标物来考查方法的检出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）。

2.5 方法回收率和精密度验证

对4种不同基质阴性样品分别进行3个质量浓度水平6次加标回收试验，考查精密度和回收率。

20种抗生素药物的线性范围、线性方程、检出限、定量限、精密度和回收率见表2，20种抗生素混合标准溶液的总离子流色谱图见图1。

2.6 实际样品的检测

表2 20种抗生素药物的线性范围、线性方程、检出限、定量限、精密度和回收率

图1 20种抗生素混合标准溶液的总离子流色谱图

用上述检测方法对市售50个化妆品样品（包括洗面奶、沐浴液、面霜、乳液等）进行了检测，在样品中部分检出四环素类药物，部分检出喹诺酮类药物，但检出率不高，且样品检测中无干扰。

3 结论

建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中多种抗菌类药物残留的检测方法，样品用甲醇溶液提取，前处理简单快捷。通过优化前处理过程和色谱质谱条件，该方法线性关系好、灵敏度高、重现性好、抗干扰能力强，适用于化妆品中多种抗菌药物残留的检测，对于化妆品的质量控制具有重要意义。