高通量测序文库构建中超声波破碎DNA条件的研究

游思亮

【摘 要】高质量的测序结果必须要有好的测序文库。本文利用超声波破碎仪Bioruptor NGS比较了不同的试验条件对破碎结果的影响，结果表明：对于目的片段为200-300bpDNA的试验条件为：100uL，浓度50ng/uL，强档能量，30s On/30s Off ， 破碎9次;目的片段为400-600bp的试验条件为：100uL，浓度50ng/uL，强档能量，30s On/30s Off， 破碎5次。

【关键词】高通量测序;超声波破碎;Bioruptor NGS

中图分类号： R318.6 文献标识码： A文章编号： 2095-2457（2019）08-0034-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.013

【Abstract】The good sample library is the prerequisite for high-throughput sequencing results. We compare the results under different conditions with ultrasonic disrupter Bioruptor NGS. The results showed that the optimal sonication conditions for 200-300bp size DNA fragments is 100uL volume， 50ng/uL， high power， 9 cycles of 30 sec On/30 sec Off; for 400-600bp size DNA fragment is 100uL volume， 50ng/uL， high power， 5cycles of 30 sec On/30 sec Off.

【Key words】High-throughput sequencing; Ultrasonic disrupter; Bioruptor NGS

0 引言

高通量测序由于其具有通量高、准确率高、相对成本低等优势，近年来的应用日益广泛[1]。高通量测序系统可以同时测定上百万条DNA序列，这使得多个样本可进行平行比较。但是，样本文库的质量在很大程度上将直接决定测序数据的质量，进而决定分析结果。因此，在高通量测序过程中，測序文库的质量控制显得尤为重要。

高通量测序技术的不断进步，也促使文库构建的方法不断改进，一般来说，文库构建的主要步骤包括：片段化及筛选特定长度的目的片段;将目的片段转化成双链DNA;在片段末端连上寡核苷酸接头;文库的质控[2]。在制备DNA样本文库的时候，DNA样本的片段化是关键的步骤[3]。DNA片段化主要是通过物理方法或酶学来实现的。Head比较了这两种方法，发现它们都很有效，不过，与物理方法相比，酶学方法会产生更多的人为插入缺失。

超声波破碎仪的基本原理是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过水而变成密集的小气泡，随着气泡炸裂而产生机械剪切力，对DNA等物质进行打断。选择超声波破碎仪进行高通量测序样本文库构建时，应满足以下几点：（1）样本之间不能有交叉污染，被污染的样本将会对测序数据产生很大的影响;（2）需要的样本量较少，一些临床样本，稀有动植物等样本的基因组DNA的提取量都不是很多，所以破碎仪对样本的需求量要少;（3）可重复性要高，如果破碎结果重复性差，会导致测序结果的重复性和稳定性也会很差 。基于以上三点，本文选择非接触式超声波破碎仪Bioruptor NGS，针对目的片段长度100～500bp筛选合适的试验条件。

1 材料与方法

（1）材料：本实验所用材料为陆地棉遗传标准系TM-1，由Kohel博士提供。单株取嫩叶用于DNA的提取，提取方法为CTAB法。

（2）仪器：Bioruptor NGS非接触式超声波破碎仪（UCD-600， 比利时Diagenode公司）、电泳仪 Power Pac（Basic Power Supply，美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统 ChemiDoc XRS（美国Bio-Rad公司）、2100生物分析仪（美国Agilent公司）、分光光度计One Drop2000（美国Thermo Scientific公司）

2 结果与讨论

2.1 总DNA质量检测

提取的总DNA条带集中清晰，表明DNA质量完好，没有出现降解情况，可用于后续试验操作。

2.2 DNA浓度的选择

选取DNA样本100uL，破碎程序30s On/30s Off，5cycles， 强档能量，选取浓度梯度10 ng/uL、50ng/uL，500ng/uL破碎基因组DNA，然后使用2100生物分析仪检测片段大小分布。结果显示：不同浓度之间的条带分布没有明显的差异，因此，考虑到后续步骤对样品的损耗，采用50ng/uL作为最终处理浓度。

2.3 超声波能量的选择

选取DNA样本100uL，浓度50ng/uL，破碎程序30s On/30s Off，10cycles，并分别用弱、中、强三个能量档次破碎DNA。通过图片可以看出随着能量的提高，条带分布逐渐集中，所以选取强档能量作为打断条件。

2.4 间隔时间

选取DNA样本100uL，浓度50ng/uL，强档能量，重复10次，分别使用程序30s On/ 30s Off、30s On/ 60s Off 、30s On/ 90s Off，分析间隔时间对破碎效果的影响。通过图片可以看出：各处理之间在片段分布上没有明显差异，说明30s的停顿时间已经可以满足试验需求，从时间成本考虑，选择30s On/30s Off作为破碎程序。

2.5 破碎次数

选取DNA样本100uL，浓度50ng/uL，强档能量，30s On/ 30s Off程序，分别破碎了5次、10次、15次，分析破碎次数对结果的影响。从图中可以看出：破碎5次时，条带分散在较大的区间范围，10次时，条带分布基本满足后续建库的要求，进一步设置不同的梯度试验，针对不同样本的建库要求，得到相应的试验条件。

3 结论

对于高通量测序建库常用的两个目的片段范围200-300bp和400-600bp，采用以下试验条件。目的长度200-300bp：样本体积100uL，浓度50ng/uL，强档能量，30s On/30s Off，破碎9次;目的长度400-600bp：样本体积100uL，浓度50ng/uL，强档能量，30s On/30s Off，破碎5次。

【参考文献】

[1]闫绍鹏，杨瑞华，冷淑娇，等.高通量测序技术及其在农业科学研究中的应用[J].中国农学通报，2012，30：171-176.

[2]岳桂东，高强，罗龙海，等.高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J].中国科学：生命科学，2012，02：107-124.

[3]于聘飞，王英，葛芹玉.高通量DNA测序技术及其应用进展[J].南京晓庄学院学报，2010，03：1-5.