纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏的保护性研究

罗敏　张辉　张丽鸿　江金欢　张妮娅　周东海

摘要：为探讨纳米硒对铬（Cr）中毒肉鸡肝脏的保护作用，试验以120只1日龄肉鸡作为模式动物，将肉鸡随机分为6组：空白对照组、Cr（Ⅵ）中毒组、保护组、治疗组、预防组和纳米硒对照组，通过观察14、21、28、35日龄肉鸡的生长性能、分析肝脏的组织病理学形态、测量体重变化和脏器指数，研究纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏损伤的防治作用及潜在的机制。结果表明，与Cr（Ⅵ）中毒组相比，纳米硒处理组肉鸡生长状况良好，且脏器指数显著低于Cr（Ⅵ）中毒组（P<0.05）；纳米硒保护组、治疗组、预防组肉鸡的肝细胞形态结构相较于Cr（Ⅵ）中毒组显著恢复。因此，纳米硒能够对Cr（Ⅵ）中毒肉鸡肝脏产生保护性作用，这为临床防治铬中毒研究及新药开发提供了新的思路。

关键词：肉鸡；肝脏；重铬酸钾；纳米硒；铬中毒

中图分类号：S859.8 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）04-0005-03

铬（Cr）是一种在自然界中广泛存在的重金属元素，而Cr（Ⅵ）作为一种强氧化剂具有高毒性，多数被用在工业生产中。不合理的使用铬会引起靶器官的肝毒性、氧化应激和细胞毒性。Cr（Ⅵ）主要通过消化道、皮肤、呼吸道这三种途径被机体所吸收[1]。经消化道和皮肤摄入少量的Cr（Ⅵ）大多数均能被还原为Cr（Ⅲ），过量的Cr（Ⅵ）则会引起皮肤过敏、皮炎、溃疡，胃肠道黏膜糜烂、胃炎、肝炎等症状；而经呼吸道摄入铬主要会对暴露于铬工厂的工人造成严重的健康危害，如：鼻中膈溃疡、鼻黏膜出血、肺炎、呼吸短促等[2]。研究表明，8 μmol/L以上的K2Cr2O7会诱使体外培养的L-02肝细胞DNA产生损伤[3]。考庆君等[4]在给大鼠日粮中添加10%LD50的K2Cr2O7后，其肝脏组织HE切片表现出明显的肝窦扩张、出血、肝细胞坏死等。王胜男[5]给肉鸡喂食K2Cr2O7后，检测到一些抗氧化酶活性指标如超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）等相比空白组明显降低。目前的研究证明铬导致机体毒性的机制主要是：Cr（Ⅵ）进入细胞后，会被抗坏血酸等还原剂还原产生活性氧簇（ROS），同时产生一些中间体导致一系列的毒性效应；并且在此过程中产生过量的Cr（Ⅲ）也会造成DNA的损伤。

根据铬中毒引起机体氧化损伤的机制，补充抗氧化剂被视为是一种良好的拮抗铬毒性的方法。研究指出，纳米硒具有较高的表面活性、吸收效率、安全性等，能够提高机体的抗氧化活力、抵抗力、改善胴体品质等[6]。当动物机体受到强氧化剂铬的损伤时，大量的不饱和脂肪酸便会被氧化形成脂质过氧化物。胥保华等[7]、胡彩虹等[8]的研究指出，添加0.3～1.0 μmol/L的纳米硒到肉鸡饲料中能够使细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）维持在一个较高的水平，该酶能够清除机体内蓄积的脂质过氧化物，从而发挥其抗氧化防御机制。

由于目前纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏的防治研究非常有限，且纳米硒具有无机硒和有机硒所不具备的高效性、低毒性、生物活性和超高的利用率。因此本试验以铬中毒肉鸡为研究对象，旨在观测纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏损伤的防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 120只1日龄AA肉鸡（购于武汉市正大公司）。

1.1.2 主要试剂及仪器 重铬酸钾（K2Cr2O7，分子质量294.19）、纳米硒（含量99.99%，200目，平均粒径40 nm），武汉谷歌生物科技公司；苏木素伊红染色试剂盒、10%福尔马林溶液，武汉博士德生物公司；RM-2245莱卡组织切片机，德国莱卡公司；KD-P摊片机、KD-H烘片机，浙江金华科迪仪器设备有限公司；OLYMPUS，CX41光学显微镜，日本奥林巴斯光学株式会社。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及给药方法 将1日龄的AA肉鸡120只饲养1周后随机分为以下6组：空白对照组（C），饲喂基础日粮和清水；铬中毒组（Ga），饲喂0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日龄；保护组（Gb），同时饲喂0.5 mg/（kg·d）的纳米硒和0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日龄；治疗组（Gc），饲喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7后饲喂2周0.5 mg/（kg·d）的纳米硒；预防组（Gd），饲喂2周0.5 mg/（kg·d）的纳米硒后饲喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7；纳米硒对照组（Ge），在日粮中添加0.5 mg/（kg·d）的纳米硒饲喂至第35日龄。自由采食及饮水，室温控制在34 ℃左右，每周控制温度下降2～3 ℃直至恒温，相对湿度为50%～65%。

1.2.2 Cr（VI）中毒肉鸡的生长性能检测 在整个试验周期中，每天定期观察并记录肉鸡临床症状变化；按照试验阶段将其分为四个染毒周期（14 d、21 d、28 d、35 d），在每个染毒周期结束时，记录肉鸡体重情况。

1.2.3 样本采集及肝脏病理切片观察 分别于第14、21、28、35天宰杀各组肉鸡5只，肝脏称重，一部分保存于-80 ℃备用，一部分固定于4%的多聚甲醛液中。固定24 h后修整组织形状，利用乙醇脱水，水杨酸甲酯过夜透明，石蜡包埋，修整蜡块，切片（厚度5～6 μm），最后H&E染色，OLYMPUS，CX41光学显微镜观察及拍照。

2 结果与分析

2.1 纳米硒对铬中毒肉鸡生长状况的影响

研究结果显示，空白对照组肉鸡生长发育良好，饮水、采食正常，精神状态良好；铬中毒组肉鸡行动迟缓，精神沉郁，食欲、饮欲明显降低，羽毛干枯不饱满；与铬中毒组相比，纳米硒对照组、保护组、治疗组、预防组肉鸡精神较好，体型较大，羽翼丰满。

2.2 纳米硒对铬中毒肉鸡体重变化的影响

由图1可见，随着饲喂时间的增长，各组肉鸡的体重依次上升；与正常对照组相比，铬中毒组肉雞体重增加较慢（P<0.05），且各时期体重最低；纳米硒对照组肉鸡整体上升趋势最为明显，且各时期体重最高（P<0.05）；除纳米硒对照组，治疗组和预防组肉鸡体重变化趋势无明显组间差异（21 d、28 d、35 d的保护组肉鸡除外）。

2.3 纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏脏器系数的影响

由图2可见，与空白对照组相比，在四个不同时期（14 d、21 d、28 d、35 d）铬中毒组肉鸡脏器系数呈显著增加趋势（P<0.05）；各试验组在第35天时脏器系数最低；在四个不同时期，纳米硒对照组与空白对照组相比其脏器系数稍高；纳米硒保护组、治疗组、预防组肉鸡脏器系数在14 d和21 d呈上升趋势，在28 d和35 d呈下降趋势，差异性均不显著（P>0.05）。

2.4 纳米硒对铬中毒肉鸡肝脏病理结构的影响

试验第14、21、28、35天肉鸡肝脏的病理结构见图3（A、B、C、D）所示。由图3可见，各时期的空白对照组肉鸡肝脏结构清晰可辨，细胞核和细胞浆均呈现正常状态；纳米硒对照组病理切片与空白对照组相比无明显差异；与空白对照组相比，铬中毒组肉鸡肝细胞索排列紊乱、肝窦间隙充满红细胞、肝窦变窄、且细胞膜结构不完整，肝细胞浆内出现大小不等、数量不一的圆形空泡，随着铬饲喂时期的延长，铬毒性所致的肝细胞结构损伤更为严重；与铬中毒组相比，不同时期的纳米硒保护组、治疗组、预防组肉鸡肝细胞结构显著恢复，但肝窦间隙仍存在少量的红细胞。

3 小结与讨论

近年来，铬在各行各业的使用及对环境造成的污染引起了人们的广泛关注，其中Cr（Ⅵ）作为强氧化剂进入机体后会导致肝脏细胞受损，进而使血液中AST、ALT、GGT水平升高；也会导致肾脏的近曲小管和肾小球损伤；上呼吸道黏膜受损出血、诱发肺水肿和呼吸困难以及使生殖器官的功能、精子活力和数量下降；DNA链断裂；红细胞破裂、机体贫血等。目前的研究观点认为Cr（Ⅵ）诱使机体一系列毒性反应的机制是其导致过度的氧化反应，产生大量自由基，机体不能及时有效清除蓄积的自由基而处于氧化应激状态[9，10]。

中国作为一个养鸡大国，其生产的肉鸡普遍销售至国外，然而由于集约化的养殖限制了肉鸡的生长，因此如何提高肉鸡胴体品质及饲料转化率等成为了人们关注的热点。大量研究表明，Cr（Ⅲ）因其介导葡萄糖耐量因子（GTF）发挥胰岛素的作用，从而促进机体摄取糖分的能力加强、脂肪水解加强、氨基酸和蛋白质合成增加[11-13]。因此越来越多的研究人员在饲料中添加铬来观察其对畜禽生长的影响，研究结果证实饲料中添加适宜剂量Cr（Ⅲ）能够促进畜禽生长发育，提高胴体品质等。但由于基层养殖人员对Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的作用机制不明确，导致Cr（Ⅵ）的错误添加，这在很大程度上影响了畜禽业的持续发展，同时也导致了严重的生物富集现象，进一步危害了人类的健康。

众所周知的是，一些天然的抗氧化剂如维C、维E、多酚、硒等能够络合重金属离子来消除其毒性，并且清除自由基而起到保护动物机体的作用[14，15]。纳米硒作为一种新型的纳米材料，结合了纳米和硒的共同优势，之前主要在大鼠上进行研究，禽类研究较少。本试验采用纳米硒作为抗氧化剂拮抗铬中毒所致的肉鸡肝脏损伤，探讨纳米硒处理后的铬中毒肉鸡肝脏的一般毒性指标和病理组织学切片变化。

大量的研究表明，衡量动物健康状况的指标有脏器的颜色、质地、光泽度、大小及质量等，而本试验通过对肉鸡铬中毒重要的靶器官肝脏及肉鸡体重进行测量分析，试验数据显示，给健康的肉鸡饮水中添加K2Cr2O7后，肉鸡体重比同时期空白对照组肉鸡体重减轻，提示Cr（Ⅵ）对肉鸡的生长发育存在一定的负面影响，而用纳米硒处理Cr（Ⅵ）中毒的肉鸡其体重明显升高，提示纳米硒能够修复铬中毒所致的机体损伤，且进一步促进肉鸡生长。脏器系数分析结果表明，铬处理肉鸡后，肉鸡肝脏/体重值增加，提示肝脏出现肿大、充血甚至变性，铬能够诱使肝脏组织病变；而纳米硒的添加能够降低肉鸡肝脏/体重值，但仍高于空白对照组肉鸡肝脏/体重值，提示纳米硒对铬所致肉鸡肝脏组织的损伤具有保护作用，但并不能完全拮抗铬对肉鸡肝脏的损害作用。

通过对处于四个不同时期的Cr（Ⅵ）暴露肉鸡肝脏的组织病理学切片观察分析，发现其肝细胞膜结构不完整，且肝细胞核固缩、破裂、溶解，甚至胞浆内出現空泡、胞核消失，疑似脂肪变性，随着攻毒时期的延长，肝窦间隙内红细胞渗出增多、肝细胞结构破坏愈加明显、且存在明显的纤维变性；在对Cr（Ⅵ）暴露肉鸡进行纳米硒处理后，观察到各纳米硒处理组肉鸡肝脏肝小叶结构清晰可辨，出现部分胞核浓染，肝窦间隙的红细胞数量减少，肝细胞肿大且胞浆内出现淡红色颗粒，疑似轻微的颗粒变性，提示纳米硒对铬中毒导致的肉鸡肝脏损伤具有缓解作用。王洋[16]发现，在肉鸡饲料中添加铬后，肉鸡肝脏内充满炎性细胞、且肝细胞索排列紊乱、出血严重；而在给铬中毒肉鸡饲喂0.63 mg/kg的亚硒酸钠后，观察到肝窦间隙出血减少、肝细胞形态结构基本恢复正常。

综上所述，纳米硒能够对Cr（Ⅵ）中毒肉鸡肝脏产生保护性作用，这为临床上铬中毒的药物开发提供了新的思路。

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