利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体 黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白

王 磊， 李冉辉， 邓湘赢， 戴 佩， 李玲玲， 罗 丹， 曾焱华*

(1.南华大学病原生物学研究所 特殊病原体防控湖南省重点实验室 湖南省分子靶标新药研究协同创新中心， 湖南 衡阳 421001； 2.邵阳市中心医院，湖南 邵阳 422000)

生殖支原体(Mycoplasmagenitalium, Mg)是一种基因组最小且能在无生命培养基中生长繁殖，同时与尿道炎、盆腔炎、不孕不育和宫颈炎等多种疾病密切相关的原核细胞型微生物[1-5]。由于Mg生长缓慢，分离培养难度大，导致其致病机制尚未完全阐明，因此，开展Mg的致病机制研究对预防和控制Mg感染具有重要意义。Mg没有细胞壁，但具有特殊的、呈烧瓶状的尖端结构。Mg主要通过其尖端结构黏附或侵入宿主细胞，从而引起宿主的感染[2]。研究表明，位于尖端结构的生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的羧基端在Mg的黏附与感染中起关键作用[6-7]。然而，迄今为止尚不清楚MgPa通过和宿主细胞膜上哪些蛋白发生相互作用，从而导致其黏附或侵入细胞引起宿主感染。本课题组在前期研究中，以重组MgPa为靶分子，从人尿道上皮细胞T 7噬菌体展示cDNA文库中筛选到MgPa互作蛋白——RPL35[8]；本研究拟构建MgPa的酵母诱饵载体，从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)酵母双杂交cDNA文库筛选能与MgPa发生相互作用的宿主蛋白，为进一步研究MgPa的功能及其在Mg致病中的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与质粒提取试剂盒 重组质粒pET-30a(+)-MgPa由课题组前期制备并保存[9]；人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)酵母双杂交cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng委托上海海科生物技术有限公司制备；膜蛋白酵母双杂交系统(DUAL membrane starter kit)和诱饵载体pBT3STE和pBT3SUC为瑞士Dual systems Biotech AG公司产品。DNA回收试剂盒和大肠埃希菌质粒提取试剂盒为Omega公司产品；酵母质粒提取试剂盒购自索莱宝公司。

1.1.2 培养基(%，质量分数) 大肠埃希菌培养基(LB)：酵母提取液0.5，蛋白胨1，NaCl 1,pH调至7.0；酵母完全培养基(YPDA)：酵母提取液1，胰蛋白胨2，葡萄糖2，腺嘌呤0.02%；酵母缺陷筛选培养基参照DUALsystem公司的DUALmembrane starter kits 说明书配制。

1.1.3 酶 高保真DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶SfiI购自Fermentas公司；DNA连接酶DNA Ligation Kit购自TOYOBO公司。

1.2 方法

1.2.1 诱饵载体构建 以pET-30a(+)-MgPa为模板，利用合成好的引物(MgPa-F：5′-AAGGCCATTACGGCCCCTAAATCACTGTGGGATCC-3′，MgPa-R：5′-CCGGCCGAGGCGGCCCCCACTACTATAGGAACAGTTACAATCAAAGG-3′)扩增目的片段并回收。将回收到的片段和诱饵载体质粒pBT3STE和pBT3SUC使用SfiI进行酶切(37 ℃、5 h)并回收。将回收后的目的片段分别与pBT3STE和pBT3SUC载体连接，将连接产物转化已制备好的大肠埃希菌感受态。随机挑取4个大肠埃希菌转化子，接种于含卡那霉素的液体LB培养基，37 ℃、250 r/min振荡培养16 h后进行PCR扩增(F引物：5′-TGGCATGCATGTGCTCTG-3′，R引物：5′-GTAAGGTGGACTCCTTCT-3′)，以对诱饵质粒进行鉴定，各选取1个阳性克隆进行质粒抽提，然后测序并对测序结果进行BLAST比对。

1.2.2 酵母转化 从YPDA平板挑取NMY32单菌落接种于4 mL YPDA液体培养基中，30 ℃，225 r/min振荡培养18～20 h至OD600>1.5；转接于50 mL YPDA液体培养基，使初始OD600约为0.2，振荡培养4～5 h，至OD600=0.6；离心收菌(4 000 r/min，5 min)；依次用20 mL无菌水、5 mL 0.1 mol/L LiAc、500 μL 0.1 mol/L LiAc重悬菌体，混匀后分装至1.5 mL离心管，每管50 μL；再依次加入50% PEG-3350 240 μL、1 mol/L LiAc 36 μL、ssDNA(20 mg/mL) 5 μL、质粒DNA 5 μL，剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。30 ℃水浴孵育30 min，42 ℃水浴孵育25 min，30 ℃水浴孵育30 min，离心收菌。用300 μL无菌水悬浮菌体，温和混匀，涂布在相应的缺陷型筛选平板上，30 ℃恒温培养4 d。

1.2.3 文库筛选与转化 从SD-L平板上挑取单克隆菌落接种于SD-L培养基50 mL，振荡培养18 h后转接于500 mL YPDA液体培养基中，使初始OD600约为0.2，振荡培养4～5 h至OD600=0.6；离心收菌(4 000 r/min，5 min)后依次用30 mL无菌水、20 mL 0.1 mol/L LiAc、10 mL 0.1 mol/L LiAc重悬菌体，混匀后离心收菌(4 000 r/min，5 min)，弃上清；向离心管中依次加入50% PEG-3350 9.6 mL、1 mol/L LiAc 1.44 mL、ss DNA (10 mg/mL) 400 μL、文库质粒DNA 25 μg，剧烈振荡1 min左右，至完全混匀；30 ℃水浴孵育30 min；42 ℃水浴热激25 min；30 ℃水浴复苏1 h；离心收菌(4 000 r/min，5 min)；用8 mL无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 μL培养物梯度稀释后涂效率平板SD-TL 3块。其余涂SD-TLH+5 mmol/L 3AT平板，每块200 μL，共40块；30 ℃恒温培养3～4 d，记录转化效率；并根据转化子数量计算筛库效率。培养到第3天时，用无菌绒布对筛库平板进行影印清除，以消除受体菌背景生长的干扰。

1.2.4 His和Ade报告基因检测 从筛库平板中共挑取38个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2～3 d，将长出的38个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA+60 mmol/L 3AT缺陷平板，30 ℃恒温培养3～4 d，以检测His和Ade报告基因。

1.2.5 阳性克隆激活LacZ报告基因的检测 将38个初始阳性克隆分别接种于SD-TL培养液振荡培养过夜，离心收菌后弃上清，在每个反应中加入100 μL裂解液混合物以重悬菌体，将其转移至ELISA板，37 ℃孵育90 min后测定每个孔对应的OD615和OD546值，分别计算相应的β-galactosidase activity=OD615/OD546。

1.2.6 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对 将通过3种报告基因检测的阳性克隆菌株分别抽提酵母质粒，然后转化大肠埃希菌Top10新鲜感受态并扩增。将含有阳性克隆的Top10转化子转接含有氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基，培养并扩增后抽提质粒，对质粒进行DNA测序和BLAST比对。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增得到MgPa片段

以MgPa-F和MgPa-R为引物，pET-30a(+)-MgPa为模板进行PCR扩增，如图1所示，在约870 bp处有一明显条带，说明成功扩增出长度为870 bp的目的片段。

2.2 诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa的鉴定

将构建好的pBT3STE和pBT3SUC分别转化大肠埃希菌，随机挑取大肠埃希菌转化子4个，用质粒引物进行PCR扩增，结果表明成功扩增出长度约1 200 bp的条带(图2)，PCR产物经测序后与预期一致。

2.3 MgPa重组质粒自激活及其功能检测

自激活检测显示pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa都有功能，且都不存在自激活现象，而pBT3SUC-MgPa的功能更强一些(图3)，因此，选用pBT3SUC-MgPa进行下一步的文库筛选。

图1 生殖支原体黏附蛋白(MgPa)PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Electrophoretic analysis of PCR product of MgPa1: PCR扩增产物；M：DNA Marker1:PCR Product; M:DNA Marker

图2 诱饵质粒菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of colonial PCR of bati plasmidM：DNA Marker；1～4：pBT3SUC-MGPA转化子PCR产物；6～8：pBT3STE-MGPA转化子PCR产物M：DNA Marker；1-4: pBT3SUC-MGPA PCR production; 6-8:pBT3STE-MGPA PCR production

图3 MgPa重组质粒自激活检测Fig.3 Self-activation detection of MgPa

1：阳性对照；2：阴性对照；3：pBT3SUC-MgPa的自激活检测；4：pBT3STE-MgPa的自激活检测；5：pBT3SUC-MgPa的功能检测；6：pBT3STE-MgPa的功能检测

1:Positive control;2:Negative control;3:Self-activation detection of pBT3SU-MgPa;4:Self-activation detection of pBT3STE-MgPa;5:Function detection of pBT3SUC-MgPa;6:Function detection of pBT3STE-MgPa

2.4 文库筛选

用含有pBT3SUC-MgPa的NMY32酵母转化子制备感受态，将文库质粒pPR3-N-207 ZengDNA转入其中，接种SD-Trp-Leu-His+5 mmol/L 3AT平板。计算筛库效率，结果共获得2.8×106个转化子，转化效率为1.1×105/μg(图4)。

图4 MgPa文库筛选效率Fig.4 Screening efficiency of MgPa library

2.5 His和Ade报告基因检测

如图5所示，从文库筛选得到的38个阳性克隆中，编号为11、13、14、15、23和26的6个克隆未能通过ADE2和HIS3报告基因检测，其余32个克隆均通过ADE2和HIS3报告基因检测。

2.6 LacZ报告基因检测

将β-galactosidase活性值与阴性对照进行比较，如其β-半乳糖甘酶活性值大于阴性对照值，则判定为通过了LacZ报告基因的检测。结果表明有6个克隆(编号分别为2、5、7、8、11、23号)未能通过LacZ报告基因检测，其余32个克隆均通过检测(图6)。因此，本研究筛选到的与MgPa相互作用的阳性克隆共有28个。

图5 阳性克隆ADE2和HIS3报告基因的检测Fig.5 Report gene detection of positive colony ADE2 and HIS31～38：克隆编号；+：阳性对照；-：阴性对照1-38：clone number；+：positive control；-：negative control

图6 MgPa阳性克隆β-半乳糖苷酶活性检测Fig.6 Activity detection of β-Galactosidase for MgPa positive colony1～38:克隆编号; 39:阳性对照; 40:阴性对照1-38：clone number； 39：positive control； 40：negative control

2.7 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对

将28个阳性克隆进行DNA测序，并在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。其中3个克隆在NCBI数据库中未查到同源序列，25个克隆分别归属于23种不同的蛋白编码基因(表1)。

表1 可能与生殖支原体黏附蛋白发生相互作用的蛋白

3 讨 论

Mg于1981年首次从非淋菌性尿道炎患者中分离出来[2]。研究表明Mg与盆腔炎、宫颈炎和非淋菌性尿道炎等疾病相关，同时也是一种艾滋病相关支原体[5,10]。Mg没有细胞壁，其细胞膜中含有较多的膜蛋白，其中含量最高的黏附蛋白(MgPa)与Mg黏附或感染宿主细胞密切相关[5]。DUALmembrane系统是一种基于分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统，能够直接在酵母内原位检测蛋白-蛋白之间的相互作用，不需要核定位信号，且泛素蛋白对相互作用蛋白的影响很小[11]。因此，该系统可以用来检测胞质蛋白与膜蛋白或者两个膜蛋白之间的相互作用。本研究首先构建了能表达MgPa的诱饵质粒，该重组质粒能正确表达并且不能自主激活报告基因，用于筛选MgPa互作蛋白的诱饵。然后将基于膜蛋白酵母双杂交的人尿道上皮细胞cDNA文库与此诱饵载体共同转化入宿主菌，再对阳性克隆进行筛选，结果共筛选到28个阳性克隆，DNA测序与BLAST比对分析的结果表明其归属于23种不同的蛋白，这些蛋白可能为与MgPa发生相互作用的蛋白。

筛选到的23个蛋白中，包含肿瘤坏死因子受体超家族成员6B、金属硫蛋白和细胞色素氧化酶等。肿瘤坏死因子受体超家族成员与其膜受体的相互作用与机体免疫系统的功能高度相关，并可能与某些获得性免疫缺陷病的病因学相关[12]。肿瘤坏死因子受体超家族成员6B，即诱捕受体3(DcR3)位于细胞膜，故推测Mg可能通过识别肿瘤坏死因子受体超家族成员6B，破坏细胞信号的正常传递，从而加速艾滋病的进展。此外，DcR3水平在胃癌、肝癌、胆囊癌、细菌感染、肾衰竭等多种疾病中均升高[13-14]。金属硫蛋白(MT)是一类分子量低、半胱氨酸含量丰富的蛋白质，与体内多种金属的转运相关。近年的研究表明，金属硫蛋白与肿瘤、中枢系统疾病、遗传性金属代谢病等多种疾病相关，且MT的过度表达与肿瘤的类型和分级相关[15-16]。本研究的结果表明，Mg感染宿主后通过MgPa与金属硫蛋白发生互作，可能会导致宿主细胞抗氧化系统的失调。细胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase，CCO)是线粒体电子传递链末端的酶，在生物体代谢过程中极其重要。研究证实HIV-Tat蛋白能够通过破坏线粒体来抑制细胞色素氧化酶的活性[17]。我们发现MgPa可能与CCO发生相互作用，表明MgPa有可能破坏宿主的能量系统从而导致宿主细胞受损。

本研究筛选到的第6个克隆为60S核糖体蛋白，与我们前期从人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库中筛选到的MgPa互作蛋白RPL35一致[8]；另外，本研究筛选到的金属硫蛋白、细胞色素C氧化酶和H3组蛋白等与邓湘赢[18]经改进的病毒铺覆蛋白印记技术和质谱分析等方法从人尿道上皮细胞膜蛋白中鉴定到的能与MgPa互作的蛋白一致。因此，这进一步说明本研究利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选到的这些蛋白可能为MgPa的互作蛋白。由于酵母双杂交试验的结果有可能存在假阳性，在下一步研究中将使用GST-pull-down和荧光能量共振转移等技术对这些蛋白进行进一步验证，并研究这些蛋白的定位及其能否抑制Mg感染人尿道上皮细胞进行进一步研究，以对其是否为Mg的受体进行确证。

总之，本研究利用膜蛋白酵母双杂交系统从人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到能与MgPa发生相互作用的蛋白，为了解MgPa的生物学功能及Mg与宿主细胞相互作用的机制提供参考。