新疆红花药用资源调研及质量品质评价*

孙宇宏，肖功胜，孙宝平，许 刚，马久太

（陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075）

红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，具有活血通经等药用功效［1］。新疆地理位置和气候条件独特，是我国红花种植主要产区，20世纪80年代，新疆区域内种植的红花产量占全国市场份额的80%［2］。新疆红花的种植区域主要集中在天山北麓的吉木萨尔、奇台及新疆西北部塔城、伊犁等地区，红花主要种植品种包括吉红一号及二号、裕民无刺等［3-4］。

本研究中通过对在新疆范围不同采集点收集的99批次的红花样品进行单指标化学成分考察（羟基红花黄色素A、山柰素）及指纹图谱相似度聚类分析，对新疆红花药用资源进行全方位系统评价，为新疆红花品质控制、中药材生产质量管理规范（GAP）种植基地建设等红花资源开发奠定重要基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（包括Waters PDAeλ二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）；MB45型快速水分测定仪、DV215CD型电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易＜上海＞有限公司）；UPT-Ⅱ-100L型超纯水仪（上海优谱实业有限公司）。

1.2 试药

山柰素对照品 （批号为110861-201209），羟基红花黄色素A对照品（批号为111637-201308），芦丁对照品（批号为100030-200707），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯；红花样品采集自新疆全境33个自然村地理位点，每个地点采集3批次样品，共采集99批次，经陕西中医学院胡本祥教授鉴定为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。

2 方法与结果

2.1 样品收集

由于新疆地区红花采用自种种植，在实地采样中，种植户对红花品种不能进行系统描述，加之红花品种在外观不易区分，造成收集样品品种信息不全，故该研究主要对红花产地进行考察。红花样品采集点地理信息见图1及表1，囊括了新疆红花产区中的伊犁州（9个自然村）、塔城地区（9个自然村）、昌吉州（12个自然村）及乌鲁木齐市周边（3个自然村），东西跨度500 km，南北跨度350 km。样品均通过手工采集，自然晾干，集中编号后，自封袋密闭包装后放入阴凉留样室避光保存备用。

2.2 羟基红花黄色素A含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

按2015年版《中国药典（一部）》红花项下羟基红花黄色素A含量测定方法进行分析。色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：甲醇 -乙腈 -0.7%磷酸溶液 （26∶2 ∶72）；检测波长：403 nm。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于 3 000［5］。

图1 红花样品采集点地理分布图

表1 红花样品地理信息及样品状态

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取羟基红花黄色素A对照品，精密称定，加25%甲醇制成每1mL含0.13mg的溶液，摇匀，即得。

就当前我国农村经济发展对于金融供给的需求，需要进行城乡经济农村金融体系改革，需要健全完善现有的农村金融体系结构，需要进一步扩充城乡经济中的金融组织队伍。可通过建立和完善多元化复合型农村金融体系：将农村政策性金融、农村合作金融和农村商业金融包含在的新型农村金融体系，建立充分发挥金融资源配置有效性的农村金融市场，从而打造一个真正支持农村发展建设的资金循环的长效机制，更好地为农村和农业的发展服务。

供试品溶液：取收集的99批次红花样品，粉碎，粉末过3号筛，称取上述粉末各0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为 300 W，频率为 50 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用25%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果见图2和图3。可见，本研究中收集到的33个种植区的99批样品中羟基红花黄色素A含量具有一定区域性，位于新疆西部的伊犁州和塔城地区的红花样品中羟基红花黄色素A的含量高于东部乌鲁木齐及昌吉产区的样品。

图2 不同采集地红花样品羟基红花黄色素A区域特征图

图3 不同采集地红花样品羟基红花黄色素A含量分布图

2015年版《中国药典》中要求红花药材中的羟基红花黄色素A含量不少于1.0%。由图3可见，99批次样品中羟基红花黄色素A含量为1.1%的样品个数最多，且不同采集点收集的99批次红花样品的羟基红花黄色素A含量均不低于《中国药典》要求。

2.3 山柰素含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：25℃ ；流动相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（52 ∶48）；检测波长：367 nm。理论板数按山柰素峰计应不低于 3 000［5］。

2.3.2 溶液制备

供试品溶液：取收集的99批次红花样品，粉碎，粉末过3号筛，称取上述粉末各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min。放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液5mL，摇匀，置水浴中加热水解30min，立即冷却，转移至25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。不同产地红花样品的山柰素测定结果见图4和图5。可见，33个采集点的红花样品中的山柰素含量同样具有区域性，位于新疆西部的伊犁州和塔城地区的红花平均含量较高（分别为0.074%和0.069% ），昌吉州次之（0.061%），最低的为乌鲁木齐市周边收集的红花样品（平均含量为0.056%）。

图4 不同采集地红花样品山柰素区域特征图

图5 不同采集地红花样品山柰素含量分布图

由图5可见，99批次样品中山柰素含量为0.054% ～0.059%的样品较集中，根据2015年版《中国药典（一部）》红花含量测定项下的山柰素含量要求不少于0.050%，有少量红花样品的山柰素含量低于《中国药典》的要求。

2.4 不同产地红花指纹图谱相似度比较及聚类分析

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：25℃；流动相：乙腈为流动相 A，0.05%三氟乙酸溶液为流动相B，按表2中的程序进行梯度洗脱；流速：1.0 mL ／min；柱温：40 ℃ ；检测波长：288 nm。

表2 红花指纹图谱测定流动相梯度洗脱程序

2.4.2 指纹图谱绘制

对照品溶液：以红花羟基黄色素A、芦丁作为参照物，取红花羟基黄色素A及芦丁对照品适量，用乙腈稀释成质量浓度为30 mg／L的对照品溶液。

供试品溶液：取收集的99批次红花样品，粉碎，粉末过3号筛，称取上述粉末各1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50mL，称定质量，加热回流90min。放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

指纹图谱绘制：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，进样测定。特征色谱图见图6，在拟订色谱条件下，出峰较多，采用对照品溶液确认其中已知成分，包括芦丁及羟基红花黄色素A。比较各批样品的色谱图，确定共有峰23个，共有指纹峰的峰面积占总峰面积的90%以上。羟基红花黄色素A为红花中的主要成分之一，可见羟基红花黄色素A的色谱峰峰位居中，峰面积所占比例较大且稳定，故选择该化合物为内参照物，确定羟基红花黄色素A的色谱峰为内参照峰。

2.4.3 方法学考察

精密度试验：取供试品（八家户村）溶液，连续进样5次。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为 0.4% ～1.1% ，0.5% ～2.7% （n＝5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取供试品（天山村）适量，精密称定，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，连续进样5次。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.1% ～1.1% ，0.2% ～1.4% （n＝ 5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品（石人子沟村）溶液，分别在 0，2，4，6，8，12 h 时进样。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.4 相似度考察

将所得色谱图采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004版（国家药典委员会）进行数据处理，将33批次红花样品色谱图进行校正匹配并比较，生成全面反映多个色谱特征的对照色图谱（图7），并以此模式为基准，计算每个色谱图与之的相似度，若相似度小于0.9则表示不同采集地的红花样品物质成分构成差异较大。

2.4.5 聚类分析

对33个不同采集地的红花样品进行指纹图谱分析，发现红花羟基黄色素A、芦丁在内的23个色谱峰，将各色谱峰相对于参比峰的峰面积量化，得33×23阶原始数据矩阵，由SPSS 16.0统计学软件进行聚类分析，采用离差平方和法（Ward′s method），并利用欧氏距离（Euclidean）作为样品的测度，聚类谱系图见图8。聚类分析将33个不同地域采集地的红花药材分为三类，其中伊犁区域种植的红花分为一类，而其他两类则分布于塔城及昌吉区域。结果显示，新疆红花药材分布复杂，其化学成分的区域性不明显。

3 讨论

图6 红花指纹图谱特征色谱图

图7 不同采集地红花样品指纹图谱比较

图8 不同采集地红花指纹图谱的聚类谱系图

红花植物体内羟基红花黄色素A及山柰素合成路径是一个庞大的系统，其中涉及合成路径中的关键酶、调控基因及环境因子等［6］，有研究发现，黄酮类化合物在红花中的累积具有明显的规律，在不同花期进行采摘，红花中上述物质的含量亦不尽相同［7-8］。

可见，不同气候及土壤特点和农户的采摘习惯导致了在33个采集点收集的红花样品主要化学成分羟基红花黄色素A及山柰素具有一定的区域性特征，位于塔城及伊犁地区的红花样品中上述化合物的含量高于其他地区。

由于红花特有的品种遗传属性，决定了来源于不同地区红花药材的内在化学品质特征存在一定差异，张戈等［9］对30余个红花品种的活性成分积累变化规律的研究结果表明，红花不同品种在活性成分积累量等方面存在差异主要由遗传因素决定，环境因素的影响居次要地位。

在对33个不同采集地收集的红花样品进行指纹图谱的测定及指纹图谱相似度聚类分析结果显示，不同采集点收集的红花样品中化合物指纹图谱聚类地域性差异不明显，这主要是由于新疆的红花种植主要通过自种繁殖，尽管不同地域间气温等环境因素存在差异，但不同地域之间种植种类互有交叉，导致地区间红花植株间遗传及化合物构成差异不明显。