上海地区临床分离念珠菌的耐药性监测

慎 慧， 郭 建， 张 旻， 孔雯娜， 肖晶晶， 吴文娟， 刘 云， 陈险峰， 谢潋滟，汤 荣， 董郭平， 李 莉， 孙 燕， 李 敏， 徐阳飏0，张静华，黄声雷，奚 卫，蔡金凤，陈祝俊，李 丽，秦惠宏， 舒 文， 曹文俊，王爱敏，卫颖珏， 黄卫春，张雯雁， 赵 虎，袁轶群0，沈振华，房 华

近年来临床上免疫功能低下人群逐年增多，侵袭性真菌感染的发生率明显上升，其中常见致病真菌包括念珠菌属、新型隐球菌和曲霉属感染的年发病率已经达到万分之一以上，念珠菌感染的发生率已经升至医院感染的第4位[1-5]。侵袭性真菌感染由于缺乏可靠有效的早期诊疗方法，病死率居高不下，念珠菌血症的病死率高达40%，侵袭性曲霉感染未能及时诊疗的病死率高达90%以上，已经成为严重威胁人类健康的感染性疾病[6-8]。

随着抗真菌药物尤其是唑类抗真菌药物如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等在临床上的大量、广泛使用，真菌耐药现象日趋严重；有些真菌如克柔念珠菌等天然耐药；真菌有高适应性特点，在体内形成生物被膜、转变成菌丝后也会高度耐药，耐药性成为侵袭性真菌感染治疗失败的主要原因之一[9-11]。尤其是近年来“超级真菌” 耳念珠菌的出现，引起了全世界临床和基础研究的科学家及疾病防控部门的高度关注[12-13]。

为了实时、动态监测上海地区医院侵袭性真菌感染病原菌的分离情况以及抗真菌药物的耐药性，2017年6月上海市卫计委成立了真菌耐药监测工作组，由东方医院作为组长单位，全市27所医院（16所三甲综合性医院，8所三甲专科医院，3所二级医院）作为成员单位。本研究对上海市真菌耐药监测工作组2017年8月-2018年4月上海地区临床分离念珠菌进行了分离鉴定和耐药性监测，了解临床分离念珠菌对常用抗真菌药物的敏感率和耐药率，引起临床医师对临床分离念珠菌及抗真菌药物合理应用的重视，为临床有效诊断、治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集 收集2017年8月1日-2018年4月30日上海地区27所医院临床分离念珠菌属菌株，剔除同一患者分离出的重复菌株。同一患者不同时间同类标本，只对初次分离菌株进行分析。所有标本来自于患者的无菌体液，包括血液、脑脊液、穿刺液及组织等以及非无菌体液如支气管肺泡灌洗液（BALF）、脓液、引流液、导管、分泌物、透析液等。

1.1.2 试剂和仪器 沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂平皿、真菌药敏接种肉汤、去离子水、药敏板（YeastOne plate）、0.5 McFarland 浊度标准品、比浊仪、Sensititre AIM加样器、SensititreVizion读板仪、Sensititre一次性加样头，均为Thermo Fisher公司商 品。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 严格按照《全国临床检验操作规程》（第4版）[14]进行，分离的真菌菌株接种至科玛嘉显色培养基或沙堡弱真菌培养基，根据生长菌落的颜色，结合VITEK 2-Compact YST卡或质谱进行初步鉴定。中心实验室（上海市东方医院南院检验科）对所有菌株均采用质谱鉴定复核，不一致者使用真菌ITS DNA序列分析确认。

1.2.2 药敏试验 采用比色微量稀释法（Sensititer Yeast one，Thermo Fisher公司），每块药敏板都包被有适当浓度的抗真菌药物和显色剂。药物包含三唑类药物氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，棘白菌素类药物卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净以及5-氟胞嘧啶和两性霉素B。药敏板在35 ℃真菌培养箱内孵育24～25 h。24 h培养后检查阳性对照生长微孔。如果生长对照孔呈红色，则为试验终点；如果生长对照孔仍然是蓝色或只有轻微紫色，则再培养24 h，检查是否有菌生长。通过配套仪器观测表现为生长抑制的最低抗真菌药物浓度即为最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌 ATCC 6258。

1.2.2 判断标准 参照2017年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）M60文件：酵母抗真菌药物敏感试验操作标准（Performance Standards for Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts）。

2 结果

2.1 菌株分布

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所医院临床分离念珠菌共354株，其中4所儿童专科医院的临床分离株占11.58%（41/354）。标本主要来自实体肿瘤患者（34.18%）、重症监护患者（24.58%）、胃肠道手术患者（13.84%）。所有标本来自患者的无菌体液如血液、脑脊液、穿刺液及组织等，以及非无菌体液如BALF、脓液、引流液、导管、分泌物、透析液等。标本分布为血液47.46%（168/354）、胸腹水11.02%（39/354）、胆汁9.60%（34/354）、引流液7.63%（27/354）、BALF 6.50%（23/354）、导管5.08%（18/354）、分泌物3.11%（11/354）、穿刺液2.26%（8/354）、脓液2.26%（8/354）、透析液1.69%（6/354）、脑脊液1.41%（5/354）、组织0.56%（2/354）、关节液0.56%（2/354）和其他体液0.85%（3/354）。临床分离念珠菌菌种标本类型分布见表1。

表1 临床分离念珠菌菌种标本类型分布及构成比Table 1 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by specimen type

所有临床分离念珠菌菌种分布见表2。其中，脑脊液标本分离的5株念珠菌分别是2株白念珠菌、2株热带念珠菌和1株近平滑念珠菌；组织标本中分离的2株念珠菌分别为白念珠菌和近平滑念珠菌。

4所儿童专科医院的41株临床分离念珠菌中包含近平滑念珠菌、白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌，分别占56.10%、24.39%、9.76%、2.44%、7.32%。本研究显示，与综合性医院相比，儿童医院的临床分离念珠菌中近平滑念珠菌数量多于白念珠菌。

2.2 念珠菌属对抗真菌药物的敏感率和耐药率

2.2.1 白念珠菌 27所医院分离的148株白念珠菌对氟康唑的敏感率为94.20%，剂量依赖性敏感（SDD）率 4.35%，耐药率1.45%；对伏立康唑的敏感率为95.65%，中介率2.17%，耐药率2.17%。白念珠菌对卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%（表3）。血液标本中共分离45株白念珠菌，对氟康唑的敏感率为93.34%，SDD率4.44%，耐药率2.22%；对伏立康唑的敏感率为91.12%，中介率6.66%，耐药率2.22%；对卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%（表4）。儿童专科医院分离的10株白念珠菌对氟康唑的敏感率为90.00%，SDD率10.00%；对伏立康唑的敏感率为90.00%，中介率10.00%；对卡泊芬净、米卡芬净、米卡芬净的敏感率均为100%，与综合性医院相比其药物敏感率无明显差异。

表2 临床分离念珠菌菌种分布及构成比Table 2 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by species

表3 上海市临床分离白念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感率和耐药率Table 3 Susceptibility of clinical Candida albicans isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.2 近平滑念珠菌 27所医院分离的84株近平滑念珠菌对氟康唑的敏感率为98.80%，SDD 率1.2%；对伏立康唑的敏感率为98.80%，中介率1.2%。近平滑念珠菌对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率均为100%（表5）。4所儿童专科医院分离的23株近平滑念珠菌对氟康唑的敏感率为95.65%，SDD率4.35%；对伏立康唑的敏感率为95.65%，中介率4.35%；对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率为100%，与综合性医院相比其药物敏感率无明显差异。

表4 血液标本分离白念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感率和耐药率Table 4 Antifungal susceptibility of the clinical Candida albicans strains isolated from blood in Shanghai

表5 临床分离近平滑念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感率和耐药率Table 5 Susceptibility of clinical Candida parapsilosis isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.3 热带念珠菌 27所医院分离的55株热带念珠菌对氟康唑的敏感率为45.45%，SDD率12.73%，耐药率41.82%；对伏立康唑的敏感率为47.27%，中介率12.73%，耐药率40.00%。热带念珠菌对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率均为100%（表 6）。

2.2.4 光滑念珠菌 27所医院分离的33株光滑念珠菌对氟康唑的SDD率93.94%，耐药率6.06%。光滑念珠菌对阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%，对卡泊芬净的敏感率为96.97%、耐药率3.03%（表7）。

由于目前CLSI尚未给出泊沙康唑、伊曲康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶对念珠菌属的药敏折点，所以无法判断该药的敏感率和耐药率，在此仅统计了这4种药物的MIC50和MIC90值（表3～表 7）。

3 讨论

近年来侵袭性真菌感染发生率逐年上升，临床上可用于侵袭性真菌感染的药物品种较少，同时由于缺乏早期快速诊断技术导致了大量预防性或者经验用药，使得真菌耐药日益严重，已经成为治疗失败的主要原因之一[9-11]。其中念珠菌是最常见的临床致病真菌，念珠菌感染的发生率已经升至医院感染的第四位[5，10]。

表6 临床分离热带念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感率和耐药率Table 6 Susceptibility of clinical Candida tropicalis strains isolated from invasive fungal infection to antifungal agents in Shanghai

表7 临床分离光滑念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感率和耐药率Table 7 Susceptibility of clinical Candida glabrata isolates to antifungal agents in Shanghai

为了掌握上海市临床真菌感染病原学及耐药状况，2017年5月上海市细菌耐药监测网更名为上海市细菌真菌耐药监测网，增设真菌耐药监测工作组，由同济大学附属东方医院为组长单位，上海地区27所医院为组员单位（含16所三甲综合性医院，8所三甲专科医院，3所二级医院）。真菌耐药监测工作组于2017年8月正式启动工作，组长单位每月对27所成员单位临床诊断侵袭性真菌感染病例分离菌株进行收集，并监测抗真菌药物敏感性，为真菌感染合理诊治提供依据。

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所医院侵袭性真菌感染临床分离念珠菌属共354株，血液标本分离念珠菌占第一位（47.46%），标本主要来源于实体肿瘤患者、重症监护患者和胃肠道术后患者，表明接受侵袭性操作、屏障破坏和免疫受损者易感性高。文献研究提示，医院内重症监护患者使用呼吸机和中心静脉导管可能是侵袭性念珠菌感染的主要危险因素；肿瘤化疗患者存在免疫功能低下和肠黏膜损伤，可导致肠道内共生的念珠菌跨过肠黏膜屏障，形成侵袭性感染；胃肠道手术后使得肠壁损伤，也可导致肠道内共生的念珠菌跨过肠黏膜屏障，形成侵袭性感染 [15-17]。

本研究临床分离念珠菌中分离率最高的仍然是白念珠菌（41.81%），Xiao等[18]报道了我国2009-2014年医院内白念珠菌在念珠菌中分离率为44.9%，说明上海地区医院内白念珠菌分离率基本与全国整体水平一致。近年来相关文献报道，非白念珠菌分离率有上升趋势，应该引起临床医师的重视[19-21]。本研究中非白念珠菌中以近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌为主（48.59%），其余念珠菌如克柔念珠菌、拟平滑念珠菌等分离率为9.6%，总体分离率基本上也与国内外报道情况一致[2-3，18]。

白念珠菌是最常见的临床致病真菌，与Yang等[22]报道2008-2012年上海瑞金医院分离侵袭性白念珠菌耐药率相比，本研究显示上海地区临床分离白念珠菌对氟康唑（1.45%对7%）和伏立康唑（2.17%对4.7%）的耐药率略有下降，可能与目前棘白菌素类抗真菌药物使用增加、唑类药物使用量减少有关，但是耐药率仍然略高于全国水平[18]；对于伏立康唑，白念珠菌的耐药率基本平稳。近年来IDSA临床指南[23]已将新型棘白菌素类药物列入念珠菌血症的初始用药（强烈推荐），本研究显示目前上海地区分离白念珠菌尚未出现耐药株。

近年来非白念珠菌分离率有上升趋势，本研究中发现上海地区侵袭性非白念珠菌中以近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌为主。本研究中近平滑念珠菌分离率在非白念珠菌分离率占比最高，其对唑类药物的耐药率低于白念珠菌，同时低于上海瑞金医院2008-2012年唑类药物耐药率[22]。本研究中93.94%光滑念珠菌对氟康唑属于SDD，仅1株光滑念珠菌对卡泊芬净耐药，对其他药物的敏感性情况基本上与白念珠菌一致。值得注意的是，热带念珠菌对唑类药物的耐药率与上海瑞金医院2008-2012年分离菌株耐药率相比显著上升，对氟康唑和伏立康唑的耐药率达到40%，显著高于Xiao等[18]在中国侵袭性真菌监测研究中的报道，需要引起临床及检验科医师的高度重 视。

综上所述，医院获得性感染的重要病原真菌的发生发展是由于抗真菌药物选择性压力、耐药基因水平传播和耐药克隆菌株传播共同作用的结果。不同的临床分离念珠菌对常见抗真菌药物的耐药性呈现差异，了解药物的敏感性，能够促进临床医师对侵袭性念珠菌感染和抗真菌药物合理应用的重视，为临床有效诊断、治疗侵袭性真菌病提供依据。