51份红三叶种质资源萌发期耐铜性评价

赵思怡， 陈 菲， 张鹤山2， 张志飞

(1.湖南农业大学农学院， 长沙 410128； 2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所， 武汉 430064)

红三叶(TrifoliumpretenseL.)是豆科(Leguminosae)三叶草属多年生草本植物，原产于小亚西亚及欧洲西南部，在我国大部分省份有栽培[1]。红三叶侧根发达，且根瘤多，耐阴性较强，可用于果树全园内或行间种植[2]，具有维持果园生态系统稳定性、培肥地力、减轻病虫杂草危害等作用。而常期喷施含铜杀菌剂或施用规模畜禽养殖粪便的老果园土壤中铜污染严重[3]。铜是植物生长发育所必需的营养元素，也是重金属污染元素，铜可维持植物正常生理代谢过程，但过量的铜会造成植物水分代谢、光合作用、呼吸作用等各种生理代谢紊乱[4]，抑制植物生长，甚至造成植物死亡。不同植物对铜胁迫的耐受性差异较大，选育高耐铜品种是解决铜污染问题较为经济便捷的措施。本研究以51份红三叶种质资源为研究对象，利用中等胁迫强度的Cu2+进行发芽实验，比较Cu2+胁迫与对照的发芽指标和根系指标差异，对发芽指标和根系指标相对值进行相关性分析与主成分分析筛选耐铜性评价指标，采用加权隶属函数法和聚类分析对51份红三叶种质资源进行耐铜性综合排序与分类，旨在研究萌发期红三叶对高铜浓度的胁迫反应，为红三叶耐铜性品种选育与推广提供依据。

表1 51份红三叶种质资源基本信息

编号材料名称编号材料名称编号材料名称编号材料名称H1CF002082H14CF022175H27CF022190H40CF022224H2CF005803H15CF022176H28CF022197H41CF022227H3CF022150H16CF022177H29CF022199H42CF022228H4CF022153H17CF022178H30CF022201H43CF022229H5CF022156H18CF022179H31CF022202H44CF022231H6CF022163H19CF022180H32CF022204H45CF022232H7CF022165H20CF022181H33CF022207H46CF022234H8CF022167H21CF022183H34CF022211H47CF022235H9CF022168H22CF022185H35CF022212H48CF022236H10CF022170H23CF022186H36CF022217H49CF022321H11CF022171H24CF022187H37CF022219H50CF022324H12CF022172H25CF022151H38CF022222H51CF022325H13CF022174H26CF022189H39CF022223

1 材料与方法

1.1 材 料

51份红三叶种质资源均由湖北省农科院畜牧兽医研究所提供(表1)，为来源于俄罗斯的野生种质资源。

1.2 试验方法

选取均匀一致、无病虫害的种子，以50%的多菌灵可湿性粉剂(山东华阳农药化工集团有限公司生产)500倍液浸泡种子20 min，用蒸馏水冲洗2～3遍待用。

参照国家牧草种子检验规程——发芽试验(GB/T 2930.4-2001)，以前期实验筛选的中等胁迫强度的Cu2+(CuSO4·5 H2O为铜源，100 mg·L-1)对51份红三叶种质资源进行铜胁迫发芽试验，以去离子水为对照，每重复50粒种子，4次重复。人工气候箱培养条件为20 ℃恒温，16 h光照/8 h黑暗培养。每隔24 h统计1次种子发芽数，逐日观察记载发芽种子数，以胚根或胚芽突破种皮长于种子长度为发芽标准，第10天结束试验。分别统计种子发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数[5]。

第10天结束试验时，每处理随机选取10株幼苗，清水洗净，以LA-S系列植物根系分析系统软件(杭州万深检测科技有限公司)进行根系扫描分析，统计总根长(mm)、根系体积(mm3)、根系表面积(mm2)、根系平均直径(mm)、根尖数(个)等。

1.3 数据处理与分析

指标相对值(%)=(指标胁迫处理值/指标对照处理值)×100%。

运用SPSS 22分析软件进行数据处理与分析。根据9个萌发指标和根系指标相对值的相关性分析和因子主成分分析结果，筛选耐铜性评价指标；以变异系数赋予权重，用加权隶属函数法计算综合隶属函数值，对51份红三叶种质资源进行耐铜性排序；用系统聚类法进行聚类。

2 结果与分析

2.1 Cu2+胁迫对红三叶种子萌发与根系生长的影响

铜胁迫处理的51份红三叶种质材料的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、总根长等5项指标显著低于空白对照(p<0.05)；根系体积、根系平均直径显著高于空白对照(p<0.05)；根系表面积、根尖数与对照无显著差异。说明100 mg·L-1Cu2+胁迫对红三叶的萌发指标有显著抑制作用，但促进根系体积、根系平均直径的发育。51份红三叶种质材料在铜胁迫下，发芽指标变异系数波动范围(64.7%～70.9%)大于对照发芽指标的波动范围(20.7%～37.2%)；根系指标的变异系数相对较小。表明在100 mg·L-1Cu2+胁迫下红三叶发芽指标的品种间差异大于根系间差异。

表2 51份红三叶种质资源不同处理下观测指标值的比较

观测指标 铜胁迫组 对照组 均值标准差变异系数/%最大值最小值均值标准差变异系数/%最大值最小值发芽势/%34.0b24.170.983.51.553.7a12.723.686.521.0发芽率/%37.3b24.164.783.51.560.5a12.520.791.529.5发芽指数30.6b21.770.778.72.950.2a15.330.580.516.8活力指数99.4b67.067.4285.612.9248.2a92.437.2459.868.9总根长/mm3.5b0.721.25.02.34.9a0.714.66.43.5根系表面积/mm27.2a1.723.610.94.47.2a1.621.710.95.0根系体积/mm31.2a0.428.22.10.70.9b0.333.01.70.5根系平均直径/mm0.7a0.06.10.70.60.5b0.112.50.70.3根尖数/个1.1a0.214.01.51.01.2a0.213.61.71.0

注：同一行的不同小写字母表示水平差异显著(p<0.05)。

表3 各指标相对值相关性分析

观测指标 相对发芽势相对发芽率相对发芽指数相对活力指数相对总根长相对根系表面积相对根系体积相对根系平均直径相对发芽率0.951∗∗相对发芽指数0.961∗∗0.950∗∗相对活力指数0.879∗∗0.870∗∗0.921∗∗相对总根长-0.384∗-0.431-0.376∗∗-0.059相对根系表面积-0.514∗∗-0.571∗∗-0.501∗∗-0.2410.926∗∗相对根系体积-0.541∗∗-0.603∗∗-0.527∗∗-0.318∗0.805∗∗0.964∗∗相对根系平均直径-0.513∗∗-0.565∗∗-0.509∗∗-0.477∗∗0.294∗0.611∗∗0.766∗∗相对根尖数-0.148-0.107-0.156-0.0150.453∗∗0.434∗∗0.401∗∗0.121

2.2 指标相对值的相关性分析

51份红三叶种质资源发芽、根系等9项指标在铜胁迫和空白对照的相对值进行两两相关性分析，结果发现：相对发芽势除与相对根尖数没有统计学相关性外，与其他7项指标均有极限著或显著相关性关系(p<0.01或p<0.05)；相对根系体积、相对根系平均直径与4项发芽指标相对值间均存在两两极限著负相关(p<0.01)，与其他3项根系指标相对值间存在极限著正相关(p<0.01)。总体来看各指标的相对值间相互关联程度较高。

2.3 耐铜性评价指标的筛选

对51份红三叶种质资源发芽、根系等9项指标在铜胁迫和空白对照的相对值进行因子主成分分析(表4、表5)。结果表明，前2个成分的累积贡献率达到82.589%，且特征值都大于1，第一主成分特征值为5.411，贡献率为60.126%，对应特征向量中载荷较大的3个指标是相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数。第二主成分特征值为2.022，贡献率为22.463%，对应特征向量中载荷较大的2个指标为相对活力指数和相对总根长。根据指标相关性分析和因子主成分分析结果，选择在第一主成分或第二主成分中特征值较大，且具有代表性的指标作为红三叶耐铜综合评价指标，分别为：相对发芽率、相对活力指数和相对总根长。

表4 3个主成分的特征值以及贡献率

主成分特征值贡献率/%累积贡献率/%Ⅰ5.41160.12660.126Ⅱ2.02222.46382.589

表5 各因子载荷矩阵

观测指标 主成分ⅠⅡ相对发芽势0.8890.378相对发芽率0.9150.337相对发芽指数0.8890.398相对活力指数0.7370.634相对总根长-0.6610.638相对根系表面积-0.8190.544相对根系体积-0.8480.459相对根系平均直径-0.7170.045相对根尖数-0.3310.538

2.4 红三叶耐铜性隶属函数综合评价以及聚类分析

51份红三叶种质资源的相对发芽率、相对活力指数、相对总根长等3项指标为红三叶耐铜性评价指标，以其变异系数赋予权重分别为0.41、0.43和0.16；以此计算综合隶属函数值(D值)(表6)。采用欧氏距离法对51份种质资源进行聚类分析。结果发现，51份红三叶在欧氏距离5处可分为3个类群。其中第1类群包括编号为H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份种质资源，其耐铜性综合隶属函数值较大，耐铜性最强。第2类群耐铜性居中，包括H 23、H 3和H 21等19份种质资源。第3类群耐铜性较弱，有H 16、H 45和H 47等26份种质资源。

表6 51份红三叶种质资源耐铜性隶属函数分析

编号指标隶属函数值相对发芽率相对活力指数相对总根长综合隶属函数值排序H10.5330.4000.3340.44420H20.3840.2210.1550.27729H30.6020.6270.4940.5968H40.5450.4670.5120.50615H50.4310.1740.0000.25234H60.5060.2960.2170.36925H70.7150.3780.0290.46118H80.7060.7720.4460.6936H90.5880.4480.2770.47817H100.9630.8490.1830.7894H110.7250.7610.4330.6945H120.6000.3200.0070.38423H130.5970.4210.1470.44919H140.6880.4090.1320.47916H151.0000.9220.1060.8232H160.3960.2740.1550.30526H170.6840.5150.4420.57210H180.6830.5520.1110.53513H190.4930.6560.3960.54812H200.5520.5450.2880.50714H210.6800.5570.4670.5939H220.4460.4000.1820.38424H230.5580.7010.4380.6007H240.8940.9530.3000.8241H250.7170.5600.1350.55611H260.1490.4911.0000.43221H270.2570.1240.3830.22037H280.3500.1220.1990.22836H290.1570.0490.1670.11247H300.2470.2460.3340.26032H310.0750.0230.1660.06750H320.1490.1380.2880.16744H330.0470.0000.2230.05551H340.0730.0710.6150.15945H350.1030.1020.5060.16743H360.1000.1110.6090.18641H370.1470.1230.5650.20339H380.0600.0260.2460.07549

续表6

编号指标隶属函数值相对发芽率相对活力指数相对总根长综合隶属函数值排序H390.0460.0480.5950.13546H400.2100.1790.5660.25433H410.1840.1810.7460.27330H420.1150.1460.4340.17942H430.2900.3620.9700.43022H440.0000.0310.4990.09348H450.1270.2950.7830.30427H460.1050.1310.6990.21138H470.1380.2160.9320.29828H480.6571.0000.7030.8123H490.1520.1670.3800.19540H500.2580.2280.3890.26631H510.2520.1410.4870.24235权重0.410.430.16

图1 51份红三叶种质资源耐铜性聚类

3 讨 论

3.1 耐铜性鉴定指标的筛选及综合评价方法

植物耐受铜胁迫的抗性机理非常复杂，可能表现为多种生理过程的综合反应[6]，多指标的综合鉴定极为重要。多指标鉴定已成为盐[7]、旱[8]、碱[9]、重金属[10-11]等非生物胁迫抗性鉴定的共识。刘红云[12]南粳39的根系净伸长量为指标对167个水稻品种耐铜性进行筛选。张黛静等[13]利用根长相对值、株高相对值、相对根系活力、总根长相对值、根体积相对值和根表面积相对值等6个生长生理指标的相对值进行平均隶属函数和聚类分析，将37个小麦品种分为强、中、弱三大类。本研究利用主成分分析和相关性分析，从9个指标中筛选出3个指标(相对发芽率、相对活力指数和相对总根长)；并根据变异系数求出各指标权重，进行隶属函数值计算，再利用聚类分析将51份红三叶种质资源分为3个耐铜性类群。本研究在较全面了解红三叶铜胁迫条件下的萌发特性和根系生长特性的前提下，利用统计学方法对众多材料进行耐铜性分类，较为准确简捷，适用于大量材料耐铜性的初级筛选。

3.2 萌发期植物耐铜性特性

植物萌发期对外界环境较为敏感，对萌发期植物材料进行抗性鉴定可操作性强、周期短、效率高[9，12]。铜主要积累在草本植物的根部，从而减少对地上部分的毒害作用[14-16]，根部危害较地上部更为明显，危害发生时间更早；但不同植物种间以及同一植物的不同品种间对铜的耐受能力差异较大。与红三叶同属植物白三叶(T.repensL.)可在质量比重1∶5的尾矿和蒸馏水的浸提液中萌发，但发芽率和胚根长度显著下降，铜尾矿中铜含量严重超过《中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准》(GB 15618-1995)三类标准，达到3 536.79 mg·kg-1。说明白三叶对铜胁迫的耐受能力较强，可作为铜尾矿修复的先锋植物[17]。白三叶、红豆草(OnobrychisviciaefoliaScop.)、柠条(CaraganakorshinskiiKom.)、胡枝子(LespedezabicolorTurcz.)等4个豆科植物的铜胁迫发芽试验结果表明，在CCu2+≤300 mg·L-1浓度范围内，红豆草的发芽率逐渐增加；CCu2+>300 mg·L-1后，随着CCu2+浓度增加，发芽率显著下降；而白三叶和柠条的发芽率在CCu2+≤300 mg·L-1浓度范围内，呈不规律变化。胡枝子的发芽率始终随着CCu2+>100 mg·L-1的浓度增加而下降。4种豆科牧草在CCu2+≤300 mg·L-1浓度范围内，根系受影响无明显规律。而CCu2+>300 mg·L-1后，根系受到明显抑制，500 mg·L-1Cu2+时，仅红豆草仍有根长，其他3种牧草已无根系发育[18]。相比较而言，蔬菜种子黄瓜(CucumissativusL.)和萝卜(RaphanussativusL.)较豆科牧草的耐铜性差。黄瓜和萝卜分别在80、100 mg·L-1Cu2+时，发芽率受到抑制；在60、40 mg·L-1Cu2+时根长受到抑制[19]。CCu2+≥80 mg·L-1时对大田作物小麦(TriticumaestivumL.)种子发芽及幼苗苗长、根长等有抑制作用[20]。本研究中用100 mg·L-1Cu2+胁迫时参试的51个红三叶种质资源的萌发指标和根长都有显著抑制作用(p<0.05)，但根系增粗，可见红三叶萌发期的耐铜性也较强。

4 结 论

100 mg·L-1Cu2+胁迫对红三叶的萌发指标和根长有显著抑制作用(p<0.05)，但促进根系增粗；根据9个指标相对值的两两相关性分析和主成分分析筛选出相对发芽率、相对活力指数和相对总根长作为红三叶萌发期耐铜性综合评价指标，51份红三叶种质资源分为三大类：H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份为耐铜性红三叶种质资源，H 23、H 3和H 21等19份为中等耐铜红三叶种质资源，H 16、H 45和H 47等26份为不耐铜红三叶种质资源。