不同pH值溶液对蓝莓种子萌发特性的影响

秦公伟 曹小勇 尚书凤 张晓娟

(1.陕西理工大学生物科学与工程学院, 陕西 汉中 723000; 2.陕西理工大学资源生物重点实验室, 陕西 汉中 723000)

蓝莓(Blueberry)又名越橘、越桔或蓝浆果，属杜鹃花科越桔属(Vacciniodeae)多年生落叶或常绿灌木。蓝莓作为当前全球第二大浆果，全世界约有400多种，广泛分布于北半球，我国有91种(28个变种)，主要分布于东北、西南与华南地区，全国形成了长白山、辽东半岛、胶东半岛、长江流域和西南5 大蓝莓主产区[1-3]。蓝莓果实为深蓝色浆果，富含有花青素苷、黄酮、叶酸、儿茶酸、类黄酮等生理活性成分，抗氧化能力居果品、 蔬菜之首, 具有提高视力、延缓衰老、增强心脏功能与防癌等多种功效[4-5]，集营养与保健于一身，具有较高经济价值和广阔的开发前景，被国际粮农组织(FAO)列为人类5大健康食品之一，被誉为“浆果之王”[6-7]。

种子繁殖是植物有性生殖的重要手段，也是联系上下代的纽带。尽管蓝莓通常以无性繁殖为主，但新品种的选育必须依靠种子繁殖[8]，且种子繁殖苗携带病毒概率低，可作为优良砧木，农业生产中具有很高利用价值。由于蓝莓种子具有休眠特性，加之体积微小，自然条件下不易萌发[9]；刘肖等研究表明，蓝莓种子萌发率低，萌发时间长，杂交种子需要55 d才能萌发，且萌芽率仅为4%[10]；较大的种子也因种皮厚而无法萌发，有的种子不能形成完整的胚，蓝莓杂交后种子发芽率低[9,11]；杨春玉等研究发现，7个蓝莓品种采收后即播发芽率为5%～19%[12]；赤霉素处理后对蓝莓种子的最高发芽率也仅为25%[13]。蓝莓种子发芽率低，无法进行有效选种，成为创新蓝莓种质资源与选育自主知识产权新品种的重要瓶颈。因此探索解除蓝莓种子休眠方法、寻找提高种子萌发的途径，对蓝莓实生苗的获得、分离世代的选择以及基因型纯合品种的选育，指导苗木生产实践均有重要意义。

种子的萌发状况是育种的关键步骤，植物种子萌发过程中受多种因素的调控，其中环境pH是重要的影响因素之一。研究表明，适宜的pH有利于种子的萌发，在花生、毛白杨、银杏等有相关的研究报道[14-16]。而种子大小作为植物生活史特征关键变量，同样与种子萌发密切相关[17]，种子大小和萌发能力的研究一直倍受重视。现有研究普遍认为，蓝莓属于“好酸”植物，适宜在酸性条件下生长，蓝莓大田栽培及离体组织培养中常常选择pH值为5.8以下的酸性环境[18-20]。而关于蓝莓种子萌发中适宜pH研究较少，不同大小级别的蓝莓种子对pH的敏感性差异目前尚无研究报道。本研究以pH为自变量，以蓝莓种子大小为调节变量，分析pH值与不同大小蓝莓种子萌发之间的关系，探寻适合蓝莓种子萌发的最佳酸碱环境条件，为蓝莓优良新品种的选育及引种栽培提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用蓝莓种子采集于陕西省汉中市定军山蓝莓生产基地，品种为蓝莓栽培品种灿烂(Brilliant)。采集所获成熟的蓝莓果实经机械压碎，加水发酵后再用1 000μm、800μm与680μm直径的网筛过滤，分为大、中、小3级，分别标记为B、M、S。从B、M、S 3级种子中随机选取若干粒，以60粒为单个处理数，分装于样品瓶中备用。

1.2 试验处理

以灭过菌的去离子水为基准溶液(pH值约6.0)，采用雷磁PHS-3 C酸度计，用1 M的HCl与NaOH调节pH值为3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0共6组梯度溶液。分别用6个梯度的溶液处理蓝莓B、M、S 3级种子，18种处理组合如表1所示。将B、M、S蓝莓种子用不同pH溶液浸泡24 h,用灭过菌的去离子水冲洗7～8次，再用对应pH溶液冲洗3～4次，将蓝莓种子均匀地播种于90 cm带纱布的灭过菌的培养皿中，每个处理60粒，重复2次。向每皿中添加等量的处理pH溶液，保证纱布充分湿润，以倾斜时培养皿底部无积水为宜，用parafilm封口膜在培养皿上下盖间隙缠绕一圈密封，确保皿内湿度相对恒定。然后将各培养皿置于温度为(25±1)℃的恒温培养箱中进行保湿培养，先黑暗培养1周，从第2周开始1 500 lx光照培养，定期观察统计各项萌发指标。

表1 pH值对不同大小蓝莓种子萌发的处理的试验

处理种子大小pH处理种子大小pH处理种子大小pH1B3.07M3.013S3.02B4.08M4.014S4.03B5.09M5.015S5.04B6.010M6.016S6.05B7.011M7.017S7.06B8.012M8.018S8.0

1.3 种子发芽指标的测定

1) 萌发率(%)=(发芽稳定后的萌发粒数/供试种子总数)×100%；

2) 发芽势(%)=[规定天数内(25 d)种子发芽粒数/供试种子粒数]×100%；

3) 子叶展开率(%)=(子叶展开数/供试种子总数)×100%；

4) 发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中，Gt为t天内的发芽种子数，Dt为发芽天数；

5) 萌发时滞(d)：第1粒种子萌发所需天数；

6) 萌发历期(d)：第1粒种子和最后1粒种子萌发时间差；

7) 胚芽长度(mm)：种子播种的第55天，从每个培养皿选取5粒萌发的种子，测定胚芽长度(若不足5粒则全部测量)；

8) 萌发值=(∑DGS/N)×Gr×10，式中，DGS为日累积萌发数除以相应的萌发天数所得商，N为从萌发开始到结束的天数，Gr为最终萌发率[21-22]。

1.4 数据分析

应用Microsoft Excel 2010软件绘制图表，SPSS 19.0统计软件进行数据分析。不同pH对蓝莓种子的发芽势、发芽率、子叶展开率、萌发指数、萌发值等的影响，采用单因素方差(One-way ANOVA)分析。若统计数据方差齐性时，采用邓肯氏新复极差法Duncan(Duncan's new multiple range test)进行多重比较；若统计数据方差不齐时，选择Games-Howell进行比较；其中p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

表2 不同大小蓝莓种子的萌发特性统计表

种子大小萌发时滞/d萌发历期/d发芽势/%萌发率/%子叶展开率/%发芽指数萌发值B14.00±1.2839.33±1.7828.61±5.9842.08±10.0438.33±15.721.17±0.24579.85±247.67M20.33±3.0234.67±3.0210.83±10.0117.12±16.1515.83±15.140.28±0.2694.34±126.85S>28—0.00±0.000.42±0.750.00±0.000.01±0.020.19±0.36

2 结果与分析

2.1 种子大小与萌发特性的关系

蓝莓种子大小不同，种子的萌发特性差异较大(表2)。B种子萌发较早,平均14 d左右，M种子萌发较B种子滞后1周左右，S种子萌发最晚，28 d才开始萌发。另外，从发芽势、萌发率、子叶展开率、发芽指数及萌发值等各项特性指标上，B种子也同样表现出显著优于M种子与S种子的萌发优势。不同大小蓝莓种子的总体萌发趋势为：B>M>S；可见，种子大小是影响蓝莓种子萌发的重要因素。

2.2 pH对蓝莓大种子(B)萌发的影响

2.2.1pH对蓝莓B种子发芽势与萌发率的影响

不同pH处理条件下，蓝莓B种子的平均发芽势为28.61%，平均萌发率为42.08%。当pH为4.0时，蓝莓B种子的发芽势为39.17%，萌发率为62.50%，在这2个指标上明显高于其他pH值组(图1-A、B)，且不同处理间差异极显著(F=55.467,p<0.01；F=114.06,p<0.01)，说明pH=4.0是蓝莓B种子萌发的合适条件。

2.2.2pH对蓝莓B种子子叶展开率与胚芽长度的影响

不同pH处理条件下，蓝莓B种子的平均子叶展开率为38.33%。在pH为4.0处理条件下，蓝莓B种子的子叶展开率达到最大值(59.17%)(图1-C)，且不同pH处理间统计检验在99%概率水平上差异显著(F=389.99,p<0.01)。蓝莓B种子胚芽平均长度为7.2 mm，实验结果表明pH=4.0时，其胚芽长度为7.8 mm(图1-D)，显著高于其他pH处理组(F=192.65,p<0.01)，由此可见pH=4.0这种偏酸环境有利于蓝莓B种子子叶的展开与胚芽的伸长。

2.2.3pH对蓝莓B种子发芽指数与萌发值的影响

发芽指数指单位时间种子发芽的个数，代表着种子的发芽速度，是种子萌发的综合评价指标。蓝莓B种子在不同pH环境条件下，发芽指数明显不同(图1-E)。当pH为4.0时发芽指数为1.56，是中性环境(pH=7.0)发芽指数的1.41倍，且方差检验结果差异极其显著(F=109.95,p<0.01)。从“萌发值”指标上分析，pH=4.0对蓝莓B种子的萌发表现出非常明显的促进优势(F=94.28,p<0.01)(图1-F)；说明pH=4.0环境条件下蓝莓B种子的萌发速度相对最快。

2.2.4pH对蓝莓B种子发芽时滞与萌发历期的影响

不同pH处理条件下，蓝莓B种子萌发时间存在差异(图1-G、H)。当pH为3.0～5.0时，蓝莓B种子的萌发时间为12～13 d,显著早于其他pH值，且不同处理间差异极其显著(F=9.60,p<0.05)；当pH=3.0与pH=4.0时，蓝莓B种子所有种子萌发完成所需时间也显著短于其他处理组(F=19.60,p<0.01)，说明较低的pH环境有利于蓝莓B种子提早萌发，而且种子萌发的时间段相对集中。

2.3 pH对蓝莓中种子(M)萌发的影响

2.3.1pH对蓝莓M种子发芽势与萌发率的影响

蓝莓M种子的发芽势与不同pH处理间存在明显的依变关系(图2-A)，pH较低(3.0)或pH较高(6.0以上)，蓝莓B种子的发芽势均表现在较低的水平上，如pH=3.0时,发芽势为4.17%，pH=8.0时,发芽势为6.67%；而pH在4.0或5.0时发芽势较高，尤其是当pH=4.0时发芽势达到最高水平(30.00%)，且不同处理间差异极显著(F=78.20,p<0.01)；对于萌发率指标而言，也表现出与“发芽势”指标类似的效应规律(图2-B)，且差异具有统计学意义(F=205.33,p<0.01)。同理说明pH=4.0对蓝莓M种子萌发比较适宜。

2.3.2pH对蓝莓M种子子叶展开率与胚芽长度的影响

蓝莓M种子的子叶展开率，在不同pH处理条件下，差异非常明显(图2-C)。当pH为7.0时，子叶展开率仅为3.33%，而仅当pH在4.0～5.0时表现出较好的子叶展开状态，且pH为4.0时达到最大值(44.17%)，不同处理间差异极其显著(F=389.70，p<0.01)。蓝莓M种子的胚芽长度平均为5.6 mm,pH为4.0时胚芽长度为7.3mm(图2-D),且统计学上99%概率水平上优于其他处理组(F=5.89，p<0.01)。

注：图中不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。下同。图1 pH对蓝莓B种子萌发特性的影响

2.3.3pH对蓝莓M种子发芽指数与萌发值的影响

M种子的发芽指数总体上小于B种子，当pH为7.0时M种子的发芽指数仅为0.11；但就M种子的6组不同pH处理而言，各组间发芽指数水平存在明显差异,pH=4.0时发芽指数达到最大值(图2-E),方差检验结果差异极其显著(F=324.378,p<0.01)。另外，在“萌发值”指标上，M种子在各pH处理间差异极其显著(F=416.89,p<0.01)，且当pH=4.0时萌发值达到相对最高水平(285.57)。

2.3.4pH对蓝莓M种子发芽时滞与萌发历期的影响

蓝莓M种子在不同pH处理条件下，萌发时滞与萌发历期差异明显(图2-G、H)。当pH为7.0时，蓝莓M种子在22 d才开始萌发；但当pH为4.0，萌发时间可比中性环境条件提早6 d左右，统计检验差异极其显著(F=19.60,p<0.01)。

图2 pH对蓝莓M种子萌发特性的影响

2.4 pH对蓝莓小种子(S)萌发的影响

不同pH对蓝莓小种子(S)萌发的影响见表3。由统计数据可以看出，在试验设计的pH范围内，蓝莓S 类种子除在个别处理上随机萌发外，其它种子几乎无萌发现象，表现出明显的休眠状态，可见蓝莓S类种子的萌发与环境pH之间没有直接的因果关联，其种子萌发与否可能在更大程度上与种子胚自身生理状态密切相关。

表3 pH值对蓝莓S种子萌发影响的统计表

pH萌发时滞/d发芽势/%萌发率/%子叶展开率/%发芽指数萌发值3—0.000.000.000.000.004291.18 0.830.000.02 0.405—0.000.000.000.000.006—0.000.000.000.000.007—0.000.000.000.000.008360.001.670.000.050.79

3 讨论与结论

植物种子休眠是植物系统发育进程中，经过长期进化和演变而获得的一种对不利环境及季节变化的生物学适应特性[23]。但对栽培物种而言, 生产上往往需要破除休眠，促进种子发芽迅速、整齐、成苗快, 从而获得较高的经济产量。研究以陕南蓝莓栽培品种灿烂(Brilliant)种子为试验材料，研究pH与不同大小蓝莓种子萌发特性之间的关系，结果表明pH与不同大小蓝莓种子的萌发水平密切相关。

种子大小是植物生活史中的 1个关键特征，作为植物生活史中重要的选择焦点，与种子的散布、萌发等密切相关[24]。Bockstaller等[25]和 Kaya等[26]认为，大种子自身营养物质丰富，萌发时可提供充足养分，利于萌发成苗；但也有研究认为，小种子抗逆性较强，具有较高的萌发率和较快的萌发速率[27]。蓝莓种子的大小与萌发水平密切相关；具体表现在大(B)、中(M)、小(S)3类种子在萌发率、发芽势、发芽指数等特性指标上差异极显著(p<0.01)，在相同的培养条件下种子越大，萌发优势相对越明显。尤其是大种子萌发势、萌发率与发芽指数显著高于M、S类种子，表现出较强的竞争力和抵御风险的能力[28-29]。可能是由于B种子的种胚发育相对完善，生理成熟度较高，种胚内萌发代谢相对比较活跃，且种子内糖类 、脂质和蛋白质等物质积累量高，能够为种子萌发提供更为丰富的营养。

种子发芽是一个需要大量能量的过程，pH对植物的营养代谢有较大的影响。现有研究认为，蓝莓属于耐酸性植物，大多数蓝莓离体培养中pH选择5.2[20]；廉家盛研究表明，蓝莓“美登”增殖培养的最适pH值为5.4[30]。pH对蓝莓(灿烂)种子萌发的影响，因种子大小而异，尤其突出地表现在对B种子与M种子的萌发态势上。不同pH环境下，蓝莓种子的萌发率差别明显。当pH为4.0时，B种子的萌发率可达62.50%，而M种子萌发率也可达到41.67%，比中性环境条件下分别提高25%和35%，而这种提高恰恰正是最适pH所引起的处理效应。研究基于种子萌发微环境pH的改变，筛选到最佳pH为4.0，证实了蓝莓种子萌发过程亦“好酸”的特点。pH之所以能够在较大程度上提高蓝莓种子萌发水平，一方面可能因为蓝莓种子种皮比较坚韧，透气性与透水性较差，而酸性条件能够腐蚀种皮，从而改善其对水分与空气的通透性，一定程度上可破除种子的机械性休眠；另一方面，较低pH(4.0)能够给蓝莓种子萌发提供合适的酸碱环境，刺激与增强萌发代谢的酶促反应，从而促进种子萌发；且较低的pH有利于蔗糖水解为葡萄糖，加快种子对营养物质的吸收。但研究发现S种子在试验处理的pH区段，除个别种子随机萌发外，pH与种子萌发特性之间并无显著效应关联；可能是由于S种子生理后熟未完成，种胚与外界的气体、水分交换，内源激素及内源物质的生理转化存在障碍，代谢相关的酶比较“迟钝”，对环境pH改变不敏感。

总之，种子的萌发特性是植物长期适应环境的表现。不同梯度pH对蓝莓种子进行浸种处理对不同大小蓝莓种子萌发特性产生的差异性影响是否与遗传机制有关，还有待进一步研究。