钙离子胁迫对3种牧草种子萌发及幼苗生长的影响

(遵义师范学院生物与农业科技学院， 贵州 遵义 563006)

钙离子是植物细胞壁的重要结构组分，也是植物必需矿质元素其中之一，在调节植物生长发育过程方面起着重要作用[1], 并且钙离子还是液泡内重要的渗透保护物质，具有维持细胞内离子平衡并保持细胞膜稳定等功能[2-5]。此外, 钙离子还是植物细胞响应环境变化非常重要的信号分子，耦连胞外环境信号与胞内生理反应，在外界信号的感应以及响应过程中起着极为重要的作用[6]。一定含量的钙可以缓解盐害、干旱、冷害、细菌等对植物造成的伤害[7-8]，对植物种子萌发和生长都有积极的影响[9]。外源钙对绝大多数植物的盐害效应具备一定程度的缓解作用，当植物受到低浓度盐胁迫时，植物可以采用增加细胞质中游离Ca2+的浓度，进而借助Ca2+与CaM的结合，启动一系列的生理生化响应机制，维持细胞质膜结构的稳定，保证光合作用的正常进行[10-11]。然而，高浓度的钙离子可以干扰植物细胞的正常生理生化功能[5]，抑制植物种子萌发，影响其光合作用[12-14], 进而抑制植物的生长发育[15]。

喀斯特地貌以裸露的石灰岩为其主要特征[16]，其面积约占地球陆地面积的12%[17]，中国约有1/3的陆地属于喀斯特地貌[18]。喀斯特地区土壤具有高钙的特点，且大多土被不连续，土层也较为浅薄，土壤中含有极为丰富钙离子, 其含量是一般酸性土壤的3倍以上[17,19]，对植物的生长和发育产生重要影响[20]。我国喀斯特地貌大多分布在人口相对集中的西南部山区，近年来随着人地矛盾日益突出，土壤侵蚀和水土流失加剧，对喀斯特地区的农业生产造成了直接威胁。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、白车轴草(TrifoliumrepensL.)和紫云英(AstragalussinicusL.)均是我国广泛栽培应用的优良牧草，同时，作为优质的绿肥作物，具备在喀斯特地区进行推广种植的潜力。目前，相关研究主要集中在这3种牧草种子的耐盐性和抗旱性方面[21-23]，关于其对高钙土壤环境的适应性方面研究较少。本实验用不同浓度的钙离子溶液模拟土壤钙离子环境，研究钙离子浓度对3种牧草种子萌发和幼苗生长的影响，为喀斯特地区适宜牧草和绿肥作物的筛选与评价提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

材料：供试种子为市场采购的湖北鑫大叶牧草公司生产的紫花苜蓿、白车轴草、紫云英种子。

试剂：氯化钙为常规分析纯无水氯化钙(无锡市亚泰联合化工有限公司)。

仪器：人工气候箱(上海博迅，BIC-400)；分析天平(上海奥豪斯，AX 523 ZH-E)；烘箱(上海一恒，DHG-9625 A)；数显游标卡尺(日本三丰，Mitutoyo)。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

试验共设置6个不同钙离子浓度处理，每处理重复4次，每重复50粒种子。采用无水氯化钙配置不同浓度的钙离子溶液，钙离子浓度梯度设置为0，0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mol·L-1。

1.2.2种子萌发试验

种子萌发处理：使用90 mm培养皿作为培养载体，采用2层滤纸法对种子进行培养处理。为保证3种牧草种子在培养皿中发芽环境大致相同，在整个发芽试验期间每隔2 d用滴管吸取相同浓度溶液对种子润洗2～3遍。整个萌发试验均在人工气候箱中展开，温度20 ℃，每日光照16 h，周期为15 d，在相同条件下萌发以排除其他因子干扰。萌发实验过程中每24 h统计1次发芽数量。种子萌发以胚根露出1 cm左右为判断标准，萌发试验结束以后称量幼苗鲜重。

恢复萌发处理：将种子萌发试验结束后培养皿中剩余未萌发的种子移出，并用蒸馏水反复冲洗3遍以上，其后将其转入加有蒸馏水的培养皿中，采用种子萌发试验相同的环境条件，在人工气候箱中继续培养10 d，每24 h统计发芽数并移除已萌发种子。

1.2.3种子萌发参数的统计和测定

种子形态:取20粒种子， 用精确度为 0.02 mm的数显游标卡尺测量种子的长度、宽度及厚度，计算平均值及标准差。

种子百粒重: 取5个重复，用精度0.000 1 g的电子天平分别称量百粒重，计算平均值及标准差。

种子含水率：称取一定量的种子于铝盒中，质量记为m0，在100 ℃烘箱中烘干至恒重，再次称重，质量记为m，种子含水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重复4次。

种子吸水率：称取一定量的种子于铝盒中，质量记为m0，加入蒸馏水至淹没所有种子，浸泡24 h，其后取出种子，擦干其表面水分，称量，质量记为m，种子吸水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重复4次。

发芽率(%)=(15 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；

发芽势(%)=(前5 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；

发芽指数=∑Gt/Dt，(式中，Gt为第t天的发芽种子数，Dt为相应的发芽日数)；

恢复萌发率(%)=(胁迫去除后恢复发芽种子数/未发芽种子总数)×100%。

表1 3种牧草种子生物学特性比较

牧草种类 种子形态/mm长宽厚百粒重/g种子含水率/%种子吸水率/%紫花苜蓿2.22±0.341.34±0.180.93±0.090.1986±0.01099.42±0.35103.03±12.57白车轴草1.14±0.090.96±0.160.68±0.060.0616±0.00088.56±1.34118.90±13.51紫云英2.81±0.331.96±0.160.78±0.100.3389±0.00223.81±0.19141.72±8.38

1.3 实验数据处理

采用SPSS 22.0统计软件对不同钙离子胁迫条件下3种牧草种子的发芽率、发芽势和发芽指数分别进行方差分析(one-way ANOVA)，并采用最小显著差异法(LSD)对其进行多重比较。同时，采用Excel 2016软件对所有数据进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 种子基本表征

3种牧草种子的生物学特性如表1。种子形态整体上紫云英>紫花苜蓿>白车轴草，百粒重也是紫云英最大为(0.338 9±0.002 2)g。紫云英不但种子较大，且种子含水率最低，小于白车轴草和紫花苜蓿。然而，紫云英种子吸水率是3种牧草种子中最大的，达(141.72±8.38)%，其次为白车轴草，再次为紫花苜蓿。

2.2 种子萌发

不同的钙离子溶液处理下3种牧草发芽率差异明显(图1)。白车轴草发芽率随钙离子浓度的增加呈下降趋势，在钙离子浓度0 mol·L-1时发芽率最大为(98.67±2.31)%。钙离子浓度0.03 mol·L-1时发芽率和0 mol·L-1时差异不显著，但显著高于其他处理。钙离子浓度0.12 mol·L-1时，发芽率快速下降，当钙离子浓度为0.15 mol·L-1时，发芽率仅为(8.00±2.00)%。紫云英发芽率也随钙离子浓度的增加而降低，钙离子浓度为0 mol·L-1时发芽率最大为(85.33±9.02)%，与钙离子浓度0.03和0.06 mol·L-1发芽率差异不显著。钙离子浓度为0.15 mol·L-1时发芽率最低为(34.67±13.32)%。紫花苜蓿发芽率随钙离子浓度增加呈先上升后下降的趋势，在钙离子浓度为0.06 mol·L-1时萌发率最大达(82.67±3.06)%，且与钙离子浓度0、0.03、0.09 mol·L-1时发芽率差异不显著(p<0.05)。钙离子浓度0.15 mol·L-1时发芽率最低为(39.33±6.43)%。总体来看，钙离子浓度0～0.09 mol·L-1时3种牧草萌发率缓慢下降趋势，钙离子浓度0.12～0.15 mol·L-1时3种牧草种子萌发率快速下降，下降幅度由大到小依次为白车轴草、紫云英和紫花苜蓿。

图1 钙离子浓度对3种牧草种子发芽率的影响

3种牧草在不同钙离子浓度溶液处理下发芽势差异明显(图2)。白车轴草和紫云英发芽势随钙离子浓度增加呈下降趋势，二者均在钙离子浓度为0 mol·L-1时发芽势最大，分别为(97.33±1.15)%和(84.67±9.02)%。白车轴草在钙离子浓度为0.12 mol·L-1时发芽势快速降低，显著低于钙离子浓度为0.09 mol·L-1，到0.15 mol·L-1时发芽势仅为(2.00±2.00)%。紫云英发芽势也在钙离子浓度为0.15 mol·L-1时逐渐降到最低为(12.67±2.31)%。紫花苜蓿发芽势随钙离子浓度增加呈先增大后减小趋势，在钙离子浓度为0.03 mol·L-1时达到最大值为(80.67±6.43)%，其后发芽势缓慢下降，到钙离子浓度为0.15 mol·L-1时最低，为(26.67±8.08)%。

图2 钙离子浓度对3种牧草种子发芽势的影响

3种牧草种子发芽指数随钙离子浓度增加均呈减小趋势(图3)。紫花苜蓿、白车轴草和紫云英均在钙离子浓度为0 mol·L-1时发芽指数最大，分别为23.21±1.99、34.25±1.76和16.63±2.61。其后发芽指数均逐渐降低，到钙离子浓度为0.15 mol·L-1时降到最低，发芽指数分别为5.38±1.35、0.62±0.22和2.78±0.83，仅分别为钙离子浓度0 mol·L-1时的23.18%、1.81%和16.72%。

图5 钙离子浓度对3种牧草幼苗生长的影响

图3 钙离子浓度对3种牧草种子发芽指数的影响

2.3 蒸馏水恢复萌发

将上述钙离子溶液各处理中不萌发的种子经过反复清洗并转入到蒸馏水中进行萌发后，3种牧草种子都快速恢复萌发，且恢复萌发率较高，达49.38%。不同钙离子浓度处理下3种牧草种子的恢复萌发率随钙离子浓度的增加呈快速增加趋势，且各钙离子浓度下，紫花苜蓿恢复萌发率均最高，其次为紫云英，再次为白车轴草(图4)。

2.4 幼苗生长

萌发结束以后，不同钙离子浓度处理3种牧草幼苗生长差异明显(图5)。白车轴草幼苗湿重随钙离子浓度增加呈减小趋势，由钙离子浓度为0 mol·L-1时的(0.006 1±0.002 7)g减少到钙离子浓度为0.15 mol·L-1时的(0.003 2±0.000 5)g。紫云英幼苗湿重随钙离子浓度也呈减小趋势，由钙离子浓度为0 mol·L-1时的(0.032 5±0.008 2)g减少到钙离子浓度为0.15 mol·L-1时的(0.007 6±0.000 9)g，且钙离子浓度为0 mol·L-1时紫云英幼苗已经长出第一片真叶。紫花苜蓿幼苗湿重随钙离子浓度增加呈先增大后减小趋势，钙离子浓度为0.03 mol·L-1时幼苗湿重最大达(0.023 7±0.003 2)g，其后湿重一直减小，到钙离子浓度为0.15 mol·L-1时最小为(0.004 9±0.000 8)g。

图4 不同钙离子浓度下牧草种子的恢复萌发率

3 讨 论

3.1 钙离子胁迫对3种牧草种子萌发的影响

紫花苜蓿、白车轴草和紫云英作为优良的牧草和绿肥作物，以其重要的饲用价值和水土保持价值，是喀斯特地区发展草地畜牧业，带动经济发展与改善生态环境的重要备选牧草品种。研究表明，白车轴草和紫云英种子发芽率、发芽势和发芽指数均随钙离子浓度的增加总体呈减小趋势，钙离子浓度较高时(0.12～0.15 mol·L-1)下降尤其明显。原因可能是随着钙离子浓度增加，胁迫增强，引起种子周围水势降低，导致细胞内外水势差随之减小，致使种子吸水困难，加之胚乳内储藏物质不能动员，呼吸作用受到强烈抑制，种子难以萌发[24]。Cai等研究发现，高浓度钙离子(0.09 mol·L-1)能够明显抑制萝卜(Raphanussativus)种子萌发[25]，与本试验研究结果相一致。同时，随钙离子浓度的增加，紫花苜蓿种子发芽率和发芽势呈先增大后减小趋势。这与刘小丽等[26]对不同钙离子浓度处理下香椿(Toonasinensis)种子发芽率、发芽指数的变化结果相一致。总的来说，低浓度钙离子胁迫对3种牧草种子发芽影响有限，而高浓度钙离子胁迫能够明显抑制3种牧草种子萌发，且低浓度钙离子(0.03～0.06 mol·L-1)胁迫可以促进紫花苜蓿种子萌发，提高其发芽率，对高钙环境的适应能力优于白车轴草和紫云英。

3.2 3种牧草种子钙离子胁迫去除后的恢复萌发能力

将萌发试验中不同钙离子浓度处理下未萌发的种子，经过反复清洗后转入到蒸馏水中继续培养，3种牧草种子均快速恢复萌发。高浓度钙离子浓度溶液中转移来的3种牧草种子其恢复萌发率均高于低浓度钙离子浓度溶液中转移来的种子，且紫花苜蓿恢复萌发率大于白车轴草和紫云英。原因可能是钙离子浓度并没有超过3种牧草种子的耐受极限，没有对牧草种子造成永久性的伤害。这与黄振英[27]、吕朝燕[28]等对NaCl胁迫下梭梭(Haloxylonammodendron)种子萌发的研究结果一致。同时，UNGAR[29]对部分一年生盐生植物(Salicorniaeuropaea，Spergulariamarina，Suaedadepressa以及Suaedalinearis)在NaCl胁迫条件下的种子萌发过程进行了系统研究，其在恢复试验中观察到了与本试验类似的恢复萌发现象。可以认为，在盐胁迫尚未超过植物种子耐受阈限时，盐浓度引起的渗透压改变限制了种子的萌发，而不是金属离子的毒性对种子造成了永久性损害，当盐胁迫减轻或消失以后，植物种子仍然具备较强的萌发能力。可见，钙离子胁迫去除以后，3种牧草种子均具有较强的恢复萌发能力，且紫花苜蓿好于白车轴草和紫云英。

3.3 钙离子胁迫对3种牧草幼苗生长的影响

钙离子在植物生长发育过程当中具有非常重要的作用，然而在喀斯特地区, 土壤中过多的钙离子可以抑制植物的正常生长，降低作物的产量, 甚至给农业生产带来严重影响[30]。试验结果表明，白车轴草和紫云英幼苗生长受到钙离子浓度的明显抑制，幼苗湿重随钙离子浓度增加而呈下降趋势。Kanashiro等[31]通过在MS培养基中添加不同浓度钙离子，发现在钙离子浓度(0.12 mol·L-1)较高时，凤梨科植物(Aechmeablanchetiana)幼苗的干重和鲜重均显著降低，这与本试验研究结果一致。同时，紫花苜蓿幼苗在钙离子浓度(0.03 mol·L-1)较低时，其生长好于其他处理，可以认为该钙离子浓度是紫花苜蓿幼苗生长的最适浓度。Al-Whaibi等[32]用不同浓度(0～0.10 mol·L-1)的CaCl2溶液处理蚕豆(Viciafaba)幼苗，研究发现0.06 mol·L-1为蚕豆幼苗生长的最适浓度，与本试验研究结果类似。总的来说，钙离子能够明显抑制3种牧草幼苗的生长，低浓度钙离子(0.03 mol·L-1)胁迫可以促进紫花苜蓿幼苗的生长。因此，初步认为紫花苜蓿对高钙环境的适应能力要好于白车轴草和紫云英，是喀斯特地区较为适宜的栽培牧草品种。