脱毒马铃薯种质资源保存新方法

包永佶 刘连成 田孝威 薛玉平 丁建国 叶 巍 鲁文娟

（威海市农业科学院，山东威海 264200）

相比马铃薯试管苗一般保存法，试管薯保存法操作更简单，1 a（年）转苗1次即可，省工省力、成本低、效果好，还能保持品种原有的特性，适用于大规模马铃薯种质资源的试管苗保存库。

马铃薯种质资源的保存主要有3种方式：块茎保存、田间保存和试管苗保存（卞春松 等，2011）。由于试管苗保存法具有保存成本低、节约空间等优点，目前世界上许多国家都采用此法保存马铃薯种质资源（杨小琴 等，2016）。试管苗保存法又可以分为一般（常温）保存法和缓慢（低温）保存法（张小川 等，2017），一般保存法是试管苗在20～24 ℃常温下不断继代培养保存资源，缓慢保存法则是通过调节培养基成分和培养环境来延缓试管苗生长或停止生长保存资源。一般保存法的缺点是需要定期转苗继代培养，通常2～3个月转苗1次（齐恩芳 等，2015），不仅需要较多的人力、物力、财力，而且多次操作会增加污染几率；缓慢保存法则对保存条件要求较高，需要一定的低温设施设备和投入资金，也提高了一般实验室对马铃薯种质资源保存的门槛。

笔者采用保存脱毒马铃薯试管薯的方式进行种质资源保存，即经过3～4个月让马铃薯试管苗在试管中自然结成试管薯，此时对试管薯不做任何处理，继续于培养室试管中保存，直至试管薯度过休眠期开始萌芽；再从试管中移出欲萌芽的试管薯，在新的培养基中进行新一轮培养，继续保存培养试管薯，整个过程可简化为脱毒试管苗→试管薯→试管苗→试管薯→微型薯。通过2 a（年）多的试验探索，发现试管薯保存法和试管苗一般保存法最终的保存效果相同，且试管薯保存法操作更简单，试管苗一般保存法1 a（年）需转苗5次，试管薯保存法1 a（年）转苗1次即可，节约了保存成本，可节省电量50%，对大规模马铃薯种质资源的试管苗保存库来说操作性更好；并且以试管薯方式保存的资源一旦需要组培快繁，则其继代培养更健壮；若进行土壤移栽种植，相比试管苗不仅成活率高、出苗壮，而且结薯产量高、个数多。据笔者了解，目前试管薯保存法尚未在马铃薯种质资源保存中规模化应用，是一种保存马铃薯种质资源的新方法。

1 试验具体操作步骤

1.1 试管苗培育 马铃薯脱毒试管苗由山东省农业科学院蔬菜花卉研究所提供，4个品种分别为鲁引1号、H2013-1、H2013-3、H2013-8。培养基：MS培养基+白糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1；将培养基（45 mL）盛入试管（30 mm×200 mm）保存脱毒试管苗。

1.2 试管苗一般保存法和试管薯保存法 试管苗一般保存法：剪取试管苗顶端（含2片叶），转移到试管中，每个品种保存2个试管，每个试管培养1株。培养温度（24±1）℃，光照16 h（小时），光照强度为2 800～3 100 lx（3个LED灯管），继代培养周期70 d（天），1 a（年）转苗5次。

试管薯保存法：剪取试管苗顶端（含2片叶），转移到试管中，每个品种保存2个试管，每个试管培养1株。培养温度（24±1）℃，光照16 h（小时），光照强度2 800～3 100 lx（3个LED灯管），培养80 d（天）。当苗高接近试管口时将LED灯管从3个调为2个，光照强度1 800～2 200 lx。继续培养110 d（天）左右，待有试管薯陆续结出后保留1个LED灯管，光照强度750～900 lx，继续在培养室中保存至试管苗叶片发黄枯萎，直至试管薯结束休眠期开始萌芽。然后将要萌芽的试管薯直接转入含有MS培养基的新试管中，每个试管保存1粒试管薯，培养温度（24±1）℃，光照16 h（小时），光照强度2 800～3 100 lx，待新芽长成新植株后，剪取幼苗顶端移入新试管中，重复保存过程。

1.3 病毒检测 两种方法保存1 a（年）后，分别用美国agdia公司生产的试纸条对试管苗进行马铃薯X病毒、Y病毒、A病毒、S病毒检测。

1.4 微型薯生产 将试管苗和试管薯分别在长×宽×高为40 cm×30 cm×15 cm规格的塑料箱内进行土壤种植，正常管理收获马铃薯微型薯。

2 保存效果

2.1 成本比较 从表1可以看出，在转苗次数上，试管苗一般保存法平均每年继代转苗5次，需要进行5次培养基配制、转苗操作、清洗等配套工序，而试管薯保存法完整配套工序只需1次，节约了物质成本和人力成本。其次，试管薯保存法降低了用电成本，试管苗一般保存法全年在恒温和恒定光照条件下继代培养；试管薯保存法在前80 d（天）与试管苗一般保存法培养条件相同，即打开3个LED灯管，第2阶段保留2个灯管培养110 d（天），到第3阶段保留1个灯管培养170 d（天），光照强度由3 100 lx减弱至750 lx，可节省电量50%左右。

2.2 试管薯结薯情况 早熟品种H2013-3最早结薯，65～70 d（天）开始出现小薯；鲁引1号次之，基本在80 d（天）结薯，以后慢慢由小到大长成试管薯，叶片变黄枯萎早，休眠时间短，萌芽也早；晚熟品种H2013-8、H2013-1试管薯结薯时间晚，95～110 d（天）陆续出现小薯，休眠期长，萌芽亦晚，由试管薯第2轮培育成为试管苗的周期更长。不同品种的试管薯结薯数量基本相同，每株结薯2～4粒，2粒居多（图1）。

在多次重复试验中发现，试管苗结薯与培养光照强度和温度有密切的关系。培养光照强度越大、温度越高，试管苗的枝叶生长越快、越健壮；试管苗培养达到成熟阶段后其结薯则是温度越低、培养时间越短、光照强度越弱越有利于结薯。由于笔者是以保存为目的，保存的时间越久越好，操作越简单越好，所以未对培养室的温度做过多调节。

表1 试管苗一般保存法与试管薯保存法对比结果

图1 试管薯结薯情况

2.3 试管薯发芽继代培育情况 和试管苗一般保存法相比，由试管薯发芽的芽苗茎更粗壮，叶片厚实且更大，颜色更深绿（图2）；两种保存方法获得的试管苗均未检测出马铃薯X病毒、Y病毒、A病毒、S病毒。

图2 试管薯发芽继代培育情况

图3 试管苗收获的微型薯

图4 试管薯收获的微型薯

2.4 微型薯生产情况 在塑料箱内进行微型薯生产，试管苗移栽和试管薯种植后均获得微型薯。试管苗移栽初期对空气湿度、温度等外界环境和管理者的要求较高；试管薯直接种植于土壤中，管理上较为宽松，成活率高于试管苗。后期正常管理，成熟后收获。结果表明，试管苗生产的微型薯偏小，但形状、大小整齐（图3）；试管薯生产的微型薯质量较大，但大小不一，整齐度偏差（图4）。两者的叶片均没有卷叶、黄叶等症状，对其进行病毒检测，也均未检测出马铃薯X病毒、Y病毒、A病毒和S病毒，收获后各品种特性无异常。

3 小结

在马铃薯种薯生产上，国家标准认定试管薯等同于试管苗均为原原种级别。马铃薯试管薯保存法完全在常规温度下进行，培养基也是采用普通MS培养基，从根本上避免了低温培养或者增添植物抑制生长成分等外界干扰给保存资源带来的不确定因素，确保了资源的纯净性。因为对培养室保存的培养条件没有特殊要求，所以一般的组培实验室都可以采用试管薯保存法保存马铃薯种质资源。在操作过程中需要注意的问题是，由于试管苗在试管中保存的时间很长，对试管塞的要求很高，笔者在自制的棉花塞外包裹双层牛皮纸确保试管口的密封性，保存过程中定时查看扎口的胶皮筋，对老化断裂的胶皮筋及时进行更换，并对培养室定期灭菌。为了更好地节省马铃薯种质资源保存成本，采用试管薯保存法时，可在保存试管薯的第3阶段让试管苗的茎叶充分枯萎，使试管薯在逐渐失去水分的培养基中保存的时间更长久。笔者又对本次试验做了后续补充，将第3阶段所得的未萌芽的试管薯仍然放置于MS培养基中，保存时间又可延长2～6个月，其发芽时间因品种的早晚成熟度而异，晚熟品种的保存时间更长，基本可达15～18个月，此结果与齐恩芳等（2015）的研究结果一致。