寄生醉马草的孢囊线虫种类鉴定

张译文，李惠霞，陈秀菊，徐鹏刚，郭 静，张淑玲

（甘肃农业大学植物保护学院 / 甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070）

醉马草(Achnatherum inebrians)是多年生草本植物，属于禾本科(Gramineae)芨芨草属(Achnatherum)，是我国北方天然草原上的一种烈性毒草，在内蒙古、西藏、青海、甘肃、新疆和宁夏等省(区)均有分布[1-3]。因其抗旱、耐寒等优势，加之有毒性，牲畜较少取食，在退化草原中蔓延日益严重[4]，直接影响了草地质量和载畜量，已成为发展草地畜牧业生产及生态环境建设的主要限制因素之一。在新疆昌吉，每年因醉马草侵占而减少的草地载畜量为200万～300万羊单位，可造成的直接经济损失超过1亿元[5]。目前关于醉马草的研究，主要集中在醉马草和内生真菌共生体方面。研究表明，内生真菌可提高醉马草的耐旱性[6]、耐寒性[7]、抗虫性[8]、抗病性[9]和对重金属胁迫的耐受性[10]；醉马草可为内生真菌的生长提供营养物质，二者为互利互惠的关系。据报道，在甘肃天然草地上，醉马草植株的内生真菌带菌率近100%[11]。郭长辉等[12]研究发现，带内生真菌醉马草根际土壤线虫密度高于不带内生真菌醉马草，并且内生真菌可以改变土壤线虫，特别是植物寄生线虫的类群组成。

线虫可寄生于植物的各个部位，导致植物生长不良，同时还会传播其他植物病害，引起植物发病[13]。孢囊线虫是线虫门侧尾腺纲垫刃目异皮科(Heteroderidae)可形成孢囊的线虫统称，是一种固着性植物线虫。孢囊线虫广泛分布于世界各地，可为害小麦(Triticum aestivum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycine max)等多种作物，造成严重的产量损失。我国每年在小麦上，禾谷孢囊线虫 (Heterodera avenaeWollenweber) 的为害面积就达 333.33万 hm2[14]，造成20%～30%的减产[15]。孢囊线虫是否可寄生在醉马草等其他禾本科植物上，目前尚未见报道。因此，本研究通过运用形态学和分子生物学相结合的方法对天祝高寒草甸醉马草根际孢囊线虫进行鉴定，以明确醉马草根部孢囊线虫的种类，为醉马草的生物防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 孢囊线虫的采集和分离

1.1.1 孢囊线虫的采集

采样地点设置在甘肃省天祝县抓喜秀龙乡、打柴沟镇。两地属大陆性高原季风气候，年均降水量400～500 mm，年均气温-2 ℃。植被类型属于草甸草原，土壤以黑钙土、栗钙土为主。

于2017年7月，依据甘肃农业大学线虫学实验室统计数据[16]，在孢囊线虫分布较多的采样点，选取醉马草生长较集中的区域，对醉马草根际10 cm范围内土壤用工兵铲进行采集，每份样品取醉马草植株1丛和根围土样约500 g，将样品用封口袋混匀密封带回实验室，放入4 ℃恒温箱保存。采样时记录经纬度、海拔、生境等信息。样品采集信息如表1所列。

1.1.2 孢囊线虫的分离

将土样放在纸上自然阴干，醉马草植株暂时放置在4 ℃恒温箱里冷藏备用。孢囊线虫的分离方法采用简易漂浮分离法，具体做法如下：将自然阴干的土样称取500 g倒入水桶中，连续搅拌，使土样充分溶解于水中，静置1 min，然后将含有土样的溶液倒入孔径为0.71 mm和0.3 mm的样品套筛(0.71 mm在上，0.3 mm在下)中，将上述步骤重复3次。用小水流冲洗0.71 mm样品筛上的杂质，尽可能使0.71 mm样品筛上的孢囊线虫冲洗至0.3 mm样品筛上，冲洗完后弃除，再用小水流小心清洗0.3 mm筛上的剩余物质，待通过筛孔的水流澄清时将0.3 mm筛上的剩余物质完全冲洗至0.15 mm尼龙纱上，在体视显微镜下挑取剩余物中的孢囊线虫，统计并收集孢囊线虫。再将醉马草植株根部白雌虫计入孢囊数据。将孢囊切开，直接可得到卵和二龄幼虫[17]。

1.2 孢囊线虫的形态学鉴定方法

在显微镜(蔡司，德国，Scope A1)和体视显微镜(蔡司，德国，Discovery V12)下，测量并拍照醉马草上分离得到的孢囊线虫孢囊、卵和二龄幼虫的主要形态特征，制作阴门锥和二龄幼虫玻片。观察和测量的形态特征包括：受精卵长、宽；二龄幼虫虫体长、体宽、基部球宽、口针长、透明尾长；孢囊长、宽；阴门锥膜孔类型，阴门膜孔长、宽，阴门裂长，下桥的有无，泡状突的有无。参考刘维志[18]和段玉玺[19]关于孢囊线虫的分类描述特征进行种类鉴定。

表1 天祝草原醉马草样品采集信息Table 1 Sampling information for Achnatherum inebrians from Tianzhu steppe

1.2.1 阴门锥玻片的制作

将饱满的孢囊线虫在盛有蒸馏水的培养皿内浸泡24 h，用毛笔尖将浸过的孢囊挑在载玻片的一边，用解剖刀切下虫体后端，用昆虫针仔细清除附着在孢囊内侧的内含物，将阴门锥的边缘修整齐，以阴门锥的面积不超过阴门锥膜孔面积的5～10倍为宜。将修整好的阴门锥放入40%的H2O2中漂白5 min，再依次放入70%、95%和100%的酒精中脱水，最后放入丁香油中透明，将透明后的阴门锥移至载玻片上观察、拍照。

1.2.2 二龄幼虫玻片的制作

将二龄幼虫吸至载玻片上的水滴中，热杀死后，用三乙醇胺-福尔马林 (Triethanolamine Formalin,TAF) 固定液固定线虫。吸取浮载剂滴至干净的玻片中间，将固定后的二龄幼虫挑至浮载剂中。选取5 mm左右的支撑物，放在浮载剂的边缘，盖上盖玻片，用滤纸吸取多余的浮载剂，用封片剂封片，待封片剂干燥后贴上标签，观察、拍照。

1.3 孢囊线虫分子鉴定

1.3.1 孢囊线虫DNA的提取

参考廖金玲等[20]的方法提取4个孢囊线虫DNA。挑取用于形态观察的孢囊线虫的卵和二龄幼虫放入灭过菌的Eppendorf管中，加入10 μL双蒸水、3 μL蛋白酶 K、7 μL 10 × PCR-buffer(含 Mg2+)，在液氮中速冻30 s，取出后用75%的乙醇消毒的玻璃研磨棒快速研磨，待Eppendorf管中液体溶解后再将其放入液氮中迅速冷冻研磨。将研磨好的样液放入-20 ℃ 的冰箱中冷冻 2 h，然后将 Eppendorf管置于 65 ℃ 下保温 1 h，94 ℃ 灭活 10 min，放入-20 ℃分装保存，备用。

1.3.2 孢囊线虫ITS1和28S核糖体DNA序列的PCR扩增

本研究采用 25 μL 的 PCR 反应体系：10 × PCR buffer(500 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，15 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL、25 mmol·L-1MgCl22.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、5 × 103mol·L-1Taq DNA聚合酶 0.2 μL、106mol·L-1上下引物各 1 μL、模板DNA 2 μL，剩余用ddH2O 补至 25 μL。以无菌水代替模板DNA作为阴性对照。ITS1-rDNA序列的扩增引物为PXb101(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT)和ChR(ACGAGCCGAGTGATCCACCG)；28S-rDNA序列的扩增引物为28-61(GTCGTGATTACCCGCTGAACTTA)和28-1001(GTTCGATTAGTCTTTCGCCCCT)。PCR扩增条件相同：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 50 s，55 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min，将扩增产物放入-20 ℃ 保存。取 5 μL扩增产物在用Goodview染色的1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为 0.1 × TAE, 100 V 下电泳 45 min，用BIORAD成像仪在紫光灯下观测。

1.3.3 扩增产物测序及序列系统发育分析

PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果用软件MAGA 6.0进行序列拼接并在Genbank上注册，在NCBI中用BLAST进行比较，下载同源性较高的序列，用最大似然法在软件MEGA 6.0中分别构建系统发育树，分析其系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 醉马草根部孢囊线虫的发生情况

本研究采集到醉马草根及根际土样共35份，有3份土样中分离到孢囊线虫，其中1份醉马草根部发现有白色雌虫寄生(图1A、B、C)。孢囊线虫的检出率为8.57%，3份样品中每100 g土样的孢囊数分别为7、23和11个。

2.2 孢囊线虫的形态学鉴定

分离自醉马草根系的孢囊线虫群体形态特征为：新鲜孢囊有亚晶层(图1C)。一个月后虫体变深褐色，呈柠檬形，角质层厚，颈部明显，有突出的阴门锥(图1D)。阴门膜孔为双膜孔(图1E)，无下桥，阴门裂明显，有发达的泡状突(图1F)。二龄幼虫为线型(图1J)，唇区圆形(图1H)，头部跟身体连接处有明显缢缩，基部球较大，口针强壮。尾部圆锥形(图1I)，透明区较长，末端尖锐，醉马草孢囊线虫主要形态测量值如表2所列。天祝地区寄生醉马草的孢囊线虫群体形态描述和测量特征值与陈品三等[21]所描述的禾谷孢囊线虫基本一致，并参考Mulvey等[22]、Handoo[23]、李惠霞等[24]对禾谷孢囊线虫形态的描述，将该线虫群体鉴定为禾谷孢囊线虫 (Heterodera avenaeWollenweber)。

2.3 孢囊线虫的分子生物学特征分析

2.3.1 ITS1核糖体DNA序列特征与聚类分析

将4个孢囊线虫扩增的ITS1-rDNA序列分别编号为：B1(MG262561)、B2(MG550972)、B3(MG550973)、B4(MG550974)。醉马草上孢囊线虫的ITS1-DNA序列长度均为792 bp，序列的一致性为100%，B1～B4与中国禾谷孢囊线虫群体(KR704399)相似性为99%。将所得序列与NCBI中下载的孢囊属(Heterodera)和球形孢囊属(Globodera)ITS-rDNA序列进行Clustal比对并构建系统发育树(图2)。结果表明：17个序列聚为3个分支，B1～B4与中国(KR704309)、捷克(KX573040)、德国(KF225722)禾谷孢囊线虫群体聚为1个分支，并与禾谷孢囊线虫复合种群中的其他5个群体 (比利时群体 AF274400、AF498381、KM504378、AF274402和美国群体GU079654)聚为一支，置信度为93%。孢囊线虫属的其他线虫群体(AY347919、AF498378、AY166438)聚为一支，置信度为100%。外群球孢囊属线虫群体(GQ294525、DQ097514)聚为一支。孢囊线虫ITS1序列类聚分析结果显示，醉马草上孢囊线虫的种类为禾谷孢囊线虫。

图1 醉马草群体孢囊线虫形态特征图Figure 1 Illustration of cyst nematodes on A. inebrians

表2 天祝醉马草孢囊线虫群体与已报道群体的孢囊、阴门锥、二龄幼虫、受精卵形态测量值Table 2 Morphometrics of cysts, vulval cones, second stage juveniles, and fertilized eggs of H. avenae in A. inebrians from Tianzhu, and other populations reported

图2 基于最大似然法构建的醉马草孢囊线虫群体1TS1核糖体DNA序列系统进化树Figure 2 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the ITS1-rDNA sequences using the maximum likelihood method

2.3.2 28S-rRNA D2～D3区序列特征与聚类分析

将4个孢囊线虫扩增的28S-rDNA序列分别编号：C1(MG266696)、C2(MG5-51855)、C3(MG551854) 、C4(MK757873)]。醉马草孢囊线虫群体的28S核糖体DNA序列长度均为1 063 bp，序列的一致性为100%，将所得序列与NCBI中下载的孢囊属和球形孢囊属28S核糖体DNA序列进行Clustal比对并构建系统发育树(图3)。结果表明，17个序列聚为3个分支，C1～C4与捷克(KX573052)、中国(GU595438)、意大利(LT159826)禾孢囊线虫群体聚为1个分支，并与孢囊线虫复合种群中的中国群体GU083592和意大利群体LT159829聚为一支。孢囊线虫属的其他线虫群体(DQ328687、DQ328691、DQ328693、JX402414、JQ040527、GU595452)聚为一支。外群球孢囊属线虫群体(EU855121、KJ409635)单独聚为一支。孢囊线虫28S序列类聚分析结果显示，醉马草上孢囊线虫的种类为禾谷孢囊线虫。

图3 基于最大似然法构建的醉马草孢囊线虫群体28S核糖体DNA部分序列系统进化树Figure 3 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the 28S-rDNA sequences using the maximum likelihood method

3 讨论

本研究中醉马草孢囊线虫的形态特征与Mulvey和Golden[22]、刘维志[18]、陈品三等[21]描述的寄生于作物的禾谷孢囊线虫一致，而与李惠霞等[24]报道的寄生于该地区矮生嵩草(Kobresia humilis)根部的禾谷孢囊线虫在孢囊宽和二龄幼虫长等特征上略有差异。但由于孢囊线虫属多个种在形态上差异较小，有时很难准确鉴定，所以需要结合分子生物学方法对孢囊线虫做进一步鉴定。目前，植物线虫的种类鉴定及系统进化研究常采用核糖体DNA(ITS序列、28S序列及18S序列)和线粒体DNA的部分序列进行[25]。本研究选用核糖体DNA的ITS1和28S基因序列对寄生于醉马草的孢囊线虫群体进行种类鉴定。鉴定结果表明，醉马草孢囊线虫的ITS1和28S序列分别与其他地方禾谷孢囊线虫序列聚为一支，有较高的同源性。分子生物学方法更进一步证明了寄生醉马草的孢囊线虫种类为禾谷孢囊线虫。

禾谷孢囊线虫主要侵染大麦属、小麦属、雀麦属、高粱属、燕麦属、剪股颖属、冰草属、看麦娘属、短柄草属、稗属、羊茅属、鹅观草属、落草属、黑麦草属、鹳草属、梯牧草属、早熟禾属、棒头草属、狗尾草属、鼠茅属等[26-33]多个属的禾本科植物。这些被禾谷孢囊线虫寄生的禾本科植物大多为小麦族和剪股颖族[34-35]。醉马草属于针茅族植物，是禾谷孢囊线虫的寄主新记录种。未来关于孢囊线虫在针茅族植物的寄主范围需要进一步研究。

本研究采集的35份醉马草根及根际土样中，3份检出禾谷孢囊线虫，线虫检出率为8.57%，远低于采样地周边燕麦田44%的孢囊线虫检出率[36]。郭长辉[37]的研究发现，带内生真菌醉马草根际土壤线虫密度高于不带内生真菌醉马草，但不带内生真菌醉马草根际土壤中植物寄生线虫的密度更高。Townsend等[38]在种植8周后的高羊茅(Festuca arundinaceae)共生体植物土壤中检测到穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)线虫的数量降低到40%；在禾草共生体上北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、禾本科根结线虫(M. graminis)、南方根结线虫(M.incognita)、M. marylandi等的数量也降低[39]。由此推测，内生真菌可能对植物线虫寄生醉马草有抑制作用，至于醉马草内生真菌与孢囊线虫之间相互影响的机制还需要进一步研究。

4 结论

本研究运用形态学观察结合核糖体DNA的ITS1、28S序列分析，对寄生于甘肃天祝醉马草根部的孢囊线虫进行种类鉴定，将其鉴定为禾谷孢囊线虫。这是首次报道禾谷孢囊线虫寄生醉马草，并可完成其生活史。