超声波和抗坏血酸处理对老化梭梭种子萌发及幼苗生理特性的影响

赵 恬，柳 旭，周文楠，潘胜难，张钰靖，钟 元，蒋文博，王佺珍

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）

种子作为遗传因素的载体之一，其品质的优劣对于农林牧业生产和种质资源保存至关重要[1]。种子在生理成熟时活力达到顶峰，之后进入不可逆的老化(aging)过程[2]。老化不仅影响种子品质和产量，还会对种质资源的安全和遗传完整性产生威胁[3-4]。种子在老化过程中体内发生一系列的细胞代谢和生理生化反应，如电解质渗漏、质膜完整性降低和脂质过氧化程度加深、保护酶系统活性降低、DNA降解、线粒体结构和功能损坏等[5-6]。关于种子老化机理，McDonald[7]和Simon[8]提出的老化自由基学说认为，种子内部自动氧化或在氧化酶的催化下产生自由基，自由基攻击膜质分子而发生脂质过氧化，引起膜脂质结构和功能发生变化，细胞膜遭到破坏，透性增加[7-8]。相关研究表明，自由基导致的膜脂过氧化反应是导致种子老化的主要原因[9-11]。此外，线粒体损伤衰老学说认为，线粒体的电子传递链是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要产生部位，种子在老化过程中产生大量ROS，引起细胞内分子的氧化损伤，从而加速种子衰老[12]。

目前关于种子活力的修复方法有引发处理、营养元素调节、生长调节剂调节、超声波处理等[13-14]。超声波 (频率高于 2 × 104Hz的弹性机械波)可以对种子产生空化效应、机械效应和热效应，对种子的细胞膜进行渗透，加速种子的新陈代谢，促进其萌发和生长。因其穿透力强、能量大、方向性强，近年来被广泛用于生物科学领域的研究[15-20]。有研究表明，超声波处理能够缩短大麦(Hordeum vulgare)种子的发芽时间[21]。抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)是植物体内的一种抗氧化剂，通过参与植物的抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)来清除细胞中的活性氧[22]，增强植物的抗逆能力[23-24]。外源AsA能够改善逆境胁迫下种子活力的研究已在甘蓝型油菜(Brassica napus)[25]和豇豆(Vigna unguiculata)[26]等植物中有所报道。

梭梭(Haloxylon ammodendron)为藜科多年生灌木或小乔木[27]，具有很强的抗旱、抗热、抗风蚀能力，是我国西北部荒漠地区优良的防风固沙植物。贮藏时间过长和贮藏方法不当易造成梭梭种子老化，因此采用有效的方法对老化种子进行修复，对种质资源的利用及贮存具有重要意义。目前单独探讨几种修复措施对老化种子活力提高的研究较多，而综合考察两种修复手段共同作用的研究甚少。因此，本研究选择超声温度、超声时间、AsA浓度、AsA作用时间作为因素，采用L9(34)的正交试验设计，综合考虑超声波和AsA是否可以缓解人工老化对梭梭种子造成的伤害，确定影响因素的主次效应并找出最优修复组合，以期提高种子产量和品质，加强梭梭种子种质资源的贮存效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源

试验中所用的梭梭种子由甘肃广恒源苗木有限公司提供，收获于2017年11月，于4 ℃冰箱贮藏至试验开始，千粒重为3.5 g，发芽率为95%。

1.1.2 种子含水量测定及含水量的调整

试验所用梭梭种子含水量为9.2%，参照国际种籽检验协会 ( International Seed Testing Association,ISTA)规程第九章的方法[28]，将种子含水量调整为12%。

1.2 种子老化处理

选取调整含水量后的健康的种子置于老化盒内的支架网上，将老化盒放入老化箱(x型电热恒温箱)，接通水源，确保湿度达到100%。采用预试验得出的适宜温度(41 ℃)和适宜时间(36 h)对种子进行老化处理。

1.3 试验设计

试验选用L9(34)正交表(表1)，将超声温度、超声时间、AsA浓度、AsA时间作为试验的4个因素，每因素设3个水平，共9个处理。用超声仪(KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司，超声频率 4 × 104Hz)对老化后的种子进行超声波处理后用AsA进行浸种，每组3个重复，对照组不做处理。

表1 超声波和AsA处理的正交因素与水平组合表L9(34)Table 1 Matrix assigned with factors and levels L9(34) under ultrasound and AsA treatments

将处理后的种子用0.1%的NaClO消毒15 min，无菌水冲洗3遍，取健康饱满的种子放于铺有滤纸的15 cm培养皿中，每皿100粒，3个重复，置于20 ℃，光暗周期 12 h/12 h (光/暗) 的光照培养箱内培养[29]。以胚根出现作为种子发芽标志，每日记录发芽数，持续到3 d发芽总数不变为止[30]，计算发芽率、发芽势及发芽指数，并测量幼苗长度。

发芽率=正常发芽种子数/供试种子数×100%;

发芽势=发芽高峰时正常发芽数/供试种子数×100%;

式中：Dt为发芽日数，Gt为与Dt对应的每天发芽数。

1.4 指标测定

种子浸出液电导率用DDS-307A型电导仪参照徐本美和韩建国[31]的方法测定，电导率 = (浸出液电导率 - 对照空白电导率)/种子质量。

生理指标的测定在幼苗生长第21天进行。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[32]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT还原法测定[33]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[32]；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法测定[32]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[34]；脯氨酸含量采用茚三酮法测定[35]。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel进行数据整理和发芽率、发芽势等发芽指标统计作图，用SPSS 22.0对发芽指标和生理指标进行组间差异显著性分析，结果用平均值 ± 标准误表示，采用 Minitab 17软件作图。

2 结果

2.1 超声波和AsA对老化梭梭种子发芽指标的影响

超声波和AsA处理老化种子后，除了第3、6、9组各项指标均显著低于对照 (CK) 外 (P＜ 0.05)，其他处理组的发芽率、发芽势、发芽指数和幼苗长度均高于对照，其中第4组(超声温度25 ℃，超声时间 40 min，AsA 浓度 300 mg·L-1，AsA 浸种时间 12 h)效果最好 (图1)。

图1 超声波和AsA处理下老化梭梭种子的发芽率、发芽势、发芽指数和幼苗长度Figure 1 Effects of ultrasound and AsA treatments on germination rate, germination energy,germination index and seeding length of aged Haloxylon ammodendron seeds

方差分析结果表明(表2)，因素A(超声温度)、B(超声时间)、C(AsA浓度)、D(AsA时间)均对发芽指数有显著影响(P＜ 0.05)；因素A、B、C均对发芽率、发芽势和幼苗长度有显著影响(P＜ 0.05)。极差分析结果(图2)表明，发芽率、发芽势、发芽指数和幼苗长度的极差大小顺序均为 A ＞ C ＞ B ＞D，因此4个因素对发芽结果的影响程度由大到小表现为 A ＞ C ＞ B ＞ D。

表2 超声波和AsA对老化梭梭种子发芽率、发芽势、发芽指数和幼苗长度影响的方差分析Table 2 Variance analyses for the models of germination percentage, germination potential, germination index,and seedling length for each of the experimental factors

图2 老化梭梭种子发芽率、发芽势、发芽指数、幼苗长度的正交试验极差分析Figure 2 Range analyses associated with the orthogonal matrix of germination percentage,germination potential, germination index, and seedling length

2.2 超声波和AsA处理对老化梭梭种子浸出液电导率、丙二醛(MDA)的影响

除第3、6、9组外，其他处理组的种子浸出液电导率均显著低于对照(P＜ 0.05)，第4组效果最好，MDA含量均显著高于对照(P＜ 0.05)，其中第4组效果最差(表3)。方差分析结果显示(表4)，因素A、B、C、D均对种子浸出液电导率有显著影响(P＜ 0.05)，因素A、C对MDA含量有显著影响(P＜ 0.05)。极差分析结果显示 (图3)，4个因素对种子浸出液电导率和MDA的影响程度顺序均为A ＞ C ＞ B ＞ D。

2.3 超声波和AsA对老化梭梭种子可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响

除第3、6、9组外，其他处理组的可溶性蛋白含量均高于对照，各组脯氨酸含量均低于对照(表3)。方差分析结果表明(表4)，因素A、C对可溶性蛋白含量影响显著(P＜ 0.05)，A、C、D对脯氨酸含量影响显著 (P＜ 0.05)。极差分析结果显示 (图3)，4个因素对可溶性蛋白和脯氨酸含量的影响程度由大到小表现为 A ＞ C ＞ B ＞ D。

表3 超声波和AsA处理下老化梭梭种子的浸出液电导率和丙二醛、可溶性蛋白、脯氨酸含量Table 3 Conductivity, MDA content, soluble protein content, and proline content with ultrasound and AsA treatments in the orthogonal matrix experiment

表4 超声波和AsA对老化梭梭种子电导率和丙二醛、可溶性蛋白、脯氨酸含量影响的方差分析Table 4 Variance analyses for the models of conductivity, MDA content, soluble protein content,and proline content for each of the experimental factors

图3 浸出液电导率、丙二醛含量、可溶性蛋白和脯氨酸的正交试验极差分析Figure 3 Range analyses associated with the orthogonal matrix of conductivity, MDA content,soluble protein content, and proline content

2.4 超声波和AsA处理对老化梭梭种子抗氧化酶活性的影响

除了第3、6、9组外，其他处理组的SOD、POD、CAT活性均显著提高，3种酶活性均在第4组达到最大值(表5)。方差分析结果表明(表6)，因素A、B、C对SOD活性有显著影响(P＜ 0.05)，因素A、B、C、D对POD和CAT的活性有显著影响(P＜ 0.05)。极差分析结果显示 (图4)，不同因素对老化梭梭种子SOD和POD的影响程度依次为A ＞C ＞ B ＞ D；对 CAT 的影响程度为 A ＞ B ＞ C ＞ D。

2.5 种子活力及生理指标的主成分分析

用SPSS 22.0通过R型主成分分析法对种子活力及各项生理指标之间的变化和相互作用进行分析(表7)。可以看出，共得到一个主成分即发芽率，贡献率为89.12%，表明发芽率与老化种子的活力紧密相关，是研究梭梭种子活力过程中的最具代表性因子，在理论上可以作为代表其他因素的指标。

表5 超声波和AsA处理下老化梭梭种子SOD、POD、CAT活性的正交试验结果Table 5 SOD, POD, and CAT activity with ultrasound and AsA treatments in the orthogonal matrix experiment

表6 超声波和AsA对老化种子SOD、POD、CAT活性影响的方差分析Table 6 Variance analyses for the models of SOD activity, POD activity, and CAT activity for each of the experimental factors

3 讨论与结论

种子在贮藏过程中会不可避免的发生老化现象，导致活力和品质逐渐降低，影响种子正常萌发和幼苗生长。采用合适的修复方法可以在一定程度上提高老化种子的活力。本研究中，除了第3、6、9组外，其他处理组的的发芽率、发芽势、发芽指数和幼苗长度均显著高于对照，这说明适宜的超声波和AsA对老化梭梭种子有较明显的修复作用，剂量不同修复效果也不同。类似研究表明，超声波处理可以提高老化高羊茅(Festuca arundinacea)和新麦草(Psathyrostachys juncea)的发芽率并促进其生长[15]，适宜浓度的AsA处理也可以提高老化向日葵(Helianthus annuus)种子的发芽率和芽长[36]。本研究中超声波和AsA的共同作用下各项发芽指标得到显著提高，原因可能在于适宜强度的超声波产生了空化作用，使得细胞质膜透性发生改变，促进胞内和胞外的物质的交换和种胚对营养物质的吸收[15]，而AsA作为小分子生理活性物质，可以激活植物根部分生组织细胞的分裂，促进种子萌发和根系的生长[36]。

种子在遭到逆境危害时，细胞膜的结构和功能受损而导致膜透性增大，电导率是衡量细胞膜透性的重要指标。有研究表明，AsA处理可以降低老化茄子(Solanum melongena)种子的浸出液电导率[37]，本研究结果表明，适宜的超声波和AsA处理可以显著降低种子的电导率，可以认为修复处理能缓解老化产生的膜损伤，细胞膜完整性得到恢复而使得外渗物减少。

图4 SOD、POD、CAT活性的正交试验极差分析Figure 4 Range analyses associated with the orthogonal matrix of SOD, POD and CAT activity

表7 总方差分解表Table 7 Total variance explained

可溶性蛋白作为植物中的营养物质，不仅为种子发芽和幼苗生长提供氮，其含量还可以反映细胞内蛋白质的合成和降解情况，因此被作为种子抗逆性的指标[2]。本研究中适宜的超声波和AsA处理后可溶性蛋白含量高于对照，原因可能在于修复处理抵御或修复了溶酶体遭到的破坏，避免了可溶性蛋白的降解，还可能因为超声波和AsA处理后种子的氧化作用减小，也避免了可溶性蛋白的大量消耗[38]。脯氨酸是植物抵御逆境环境的主要渗透调节物质，很多研究认为，植物体内的脯氨酸含量可以作为其抗逆性的参考指标，植物在逆境胁迫下会产生一些溶质如脯氨酸来进行自我保护，抵抗不良环境[39-40]。在本研究中各组的脯氨酸含量均低于对照，但规律性不强，可能是因为修复作用对脯氨酸影响不大，具体机理有待进一步研究。

衰老过程中种子体内的代谢系统发生紊乱，产生大量的活性氧和自由基而导致膜脂过氧化损伤。SOD、POD、CAT是植物体内重要的保护酶，可清除过氧化产生的自由基，因此这3种酶活性的变化可以反映植物细胞的膜脂过氧化情况[41]。对棉花(Gossypium hirsutum)[42]、茄子(Solanum melongena)[43]等老化种子的研究均发现AsA能显著增强SOD、POD、CAT的活性。本研究中上述3种酶活均在适宜的超声波和AsA处理后显著高于对照，表明修复处理可以提高抗氧化酶活性，抗氧化酶进一步清除种子体内的活性氧和自由基，抵抗老化对种子产生的伤害。这与柳旭等[44]对老化高羊茅的研究结果类似。MDA作为细胞脂质过氧化的终产物，经过修复处理后含量相比对照显著降低，说明修复处理通过增强抗氧化酶的活性，使得种子体内的活性氧得到及时清除而缓解了膜脂过氧化损伤。

超声波和AsA对老化梭梭种子的处理效果受到超声温度、超声时间、AsA浓度和AsA浸种时间四因素的影响，正交试验的极差和方差分析表明超声温度为影响梭梭种子萌发各项指标的最主要因素，柳旭等[44]在对3种老化牧草种子的研究中也有类似发现。Liu等[15]研究表明，过高的超声温度会破坏质膜系统、引起蛋白质变性和肽键断裂等，导致种子活力降低甚至死亡。本研究中第3、6、9组各项指标异常的原因可能是超声温度过高(55 ℃)而对种子产生了致命的伤害。

通过主成分分析得到了发芽率是研究梭梭种子活力的最具代表性因子，发芽率的最优处理组合即可代表种子的最佳处理组合，极差分析(图2)表明发芽率的优水平组合为A1B1C2D3，因此本研究中超声波和AsA对老化梭梭种子的最佳修复条件超声温度 25 ℃，超声时间 20 min，AsA 浓度 300 mg·L-1，AsA 作用时间 24 h。