糖尿病加重主动脉缩窄小鼠模型心力衰竭的研究

郝文静 李玉琳 乔博康 张聪聪 杜杰

心力衰竭（heart failure HF，）是由于心脏结构和（或）功能异常，导致心室充盈或射血能力受损的一种复杂综合征的临床综合征[1-2]。尽管药物治疗、外科手术以及介入技术的水平都大大提高，但心力衰竭仍是全球发病率、死亡率很高的疾病。究其原因一方面是由于目前对心力衰竭发病机制的研究还不是十分透彻，另一方面是导致心力衰竭发生的因素多种多样[3]。心力衰竭也是很多疾病发生发展的终末死亡原因。大规模流行病学研究表明糖尿病会使心血管疾病的危险性显著上升，不仅会增加心血管疾病的发病率与病死率，也增加了总死亡率[4-5]。然而糖尿病加重心力衰竭的研究尚不完善，本研究通过以自发性2型糖尿病模型dbdb小鼠复制主动脉缩窄模型，旨在观察糖尿病对心功能衰竭的促进作用研究。

材料与方法

1.材料和主要试剂 雄性7周龄C57BL/6 J小鼠15只，无特定病原体（SPF）级，体质量23～25 g，由华阜康生物科技股份有限公司提供，在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物中心所属的SPF级动物房饲养。雄性7周龄dbdb糖尿病小鼠15只，无特定病原体（SPF）级，体质量在20～25 g之间，由南京动物研究所提供，在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物中心所属的SPF级动物房饲养。苏木素（中国Mayer公司）伊红（中国Mayer公司）Vivid小动物超声心动仪（英国GE Healthcare公司）。

2.方法 将实验动物分为四组。野生型（WT）假手术组（A组），糖尿病模型（dbdb）小鼠假手术组（B组），WT+主动脉缩窄术（TAC）组（C组）；及dbdb老鼠+主动脉缩窄术（TAC）组（D组）。构建两组小鼠主动脉缩窄术模型：手术器械高压灭菌，手术台面依次用乙醇消毒，小鼠经腹腔注射戊巴比妥后，小鼠颈部至剑突、俩侧上肢间胸部皮肤经脱毛备皮，小鼠仰卧位，四肢经医用胶带固定于手术操作板上，从颈部开一个越3～4 cm的纵行切口，用粗的弯镊剥开甲状腺，然后用精细直镊剥离暴露气管，沿气管正中剪开胸骨，在显微镜下找到胸腺用精细直镊分离胸腺暴露主动脉弓后，用针带线把线穿过主动脉弓并在放置垫针的情况下接扎主动脉弓，撤掉垫针，然后关闭胸腔封皮即可。[6]在主动脉缩窄术（TAC术）后1周，超声检测胸主动脉流速水平，流速值平稳于3 000以上，表示小鼠心力衰竭模型建立成功。

3.组织病理切片制备 小鼠在0.1%戊巴比妥钠麻醉的情况下，使用肝素化0.9%氯化钠溶液进行心脏灌注，直至将所有血液去除干净后，剪下小鼠心脏组织，一部分在4%多聚甲醛中固定过夜，然后进行脱水包埋制作石蜡切片。采用Masson法观察四组小鼠心脏间质中胶原的沉积，采用苏木精一伊红（HE）染色法和麦胚凝集素（WGA）染色法检测四组小鼠心肌细胞肥厚面积。

4.心脏超声的测定 应用1%的戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行腹腔注射麻醉；用脱毛膏将小鼠胸部的毛发脱去；将小鼠平躺固定；用连接好的探头对动物开始扫描成像，并保存图像；将所保存的图像导入分析软件中进行分析，将算出的数据进行统计。

5.蛋白质印迹法检测AKT2的表达 AKT2磷酸化及AKT2蛋白表达，每组各取4只小鼠于主动脉缩窄术（TAC）处理8周后，收取整个心脏组织，加入组织裂解液并用粉碎仪粉碎组织提取组织总蛋白。BCA法测定蛋白质含量。每组取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移到A硝酸纤维素膜上，用5%的BSA封闭液封闭1～2 h，加入一抗（兔抗小鼠p-AKT2、AKT2、为1:1 000，GAPDH单克隆抗体1:1 000），4℃孵育过夜，TBST缓冲液（0.05%Tween20的TBST缓冲液）洗膜10 min×3次，以1:5 000稀释HRP标记的荧光二抗，室温避光孵育1 h，常规洗膜，用Odyssey扫描仪扫膜仪扫描并进行光密度值分析。

6.统计学方法应用GraphPad Prism7.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，四组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.糖尿病模型及心力衰竭模型构建成功 与野生WT组相比糖尿病模型dbdb小鼠组的血糖明显升高（P＜0.01），表示糖尿病的模型成功，两组小鼠在主动脉缩窄术后1周主动脉弓部血流的流速值均＞3 000，表示两组小鼠心力衰竭模型建立成功（图1）。

2.糖尿病对主动脉缩窄术诱导心力衰竭小鼠的心率和血压无影响 心率和血压也是影响心力衰竭的重要因素，A组和B组比较 主动脉缩窄术后0、8周小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压均无显著升高（均P＞0.05），两组间心率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05，图2）。

图1 两组小鼠的血糖及主动脉缩窄术后主动脉流速变化情况 A：两组 两组小鼠的血糖值；B：两组小鼠术1周后的流速变化

3.糖尿病促进主动脉缩窄术诱导心力衰竭小鼠心功能的恶化 糖尿病dbdb小鼠和对照WT小鼠行主动脉缩窄手术，术后0周、2w、4周、6w、8周超声监测小鼠的心功能变化显示，术后4周反映心功能指标的EF明显降低，D组与C组比较，D组较C组降低更显著，有统计学意义（P＜0.05）。光镜下四组小鼠比较，假手术及主动脉缩窄术8周后的小鼠心脏组织切片及HE染色结果表明，HE染色红色为心肌细胞质，细胞核深蓝色，主动脉缩窄术8周后糖尿病（dbdb）小鼠组心脏炎症浸润明显加重。镜下心脏组织的Masson染色结果比较发现，Masson染色后胶原纤维为蓝色，C组和D组小鼠心脏均有表达，但D组心脏组织中胶原增加更明显，心脏纤维化面积明显大于C组小鼠[C组vs.D组：（4.07±0.37）%vs.（5.85±0.48）%，（P＜0.05）]，差异有统计学意义；A组与B组比较差异无统计学意义[A组vs.B组：[（0.95±0.13）%vs.（1.03±0.06）%，P＞0.05]，见图3。

图2 两组小鼠主动脉缩窄术0周、8w后心率及血压的变化 A：两组小鼠术后心率的变化；B～D：两组小鼠术后小鼠血压的变化，注：与对照组相比，均P＞0.05

图3 两组小鼠在主动脉缩窄术后小鼠心功能变化情况 A～B：两组小鼠不同时间点后心脏射血分数及心功能超声大体图变化，C：两组小鼠术后8周进行石蜡切片和HE染色（×200），D～E：两组小鼠小鼠心脏Masson染色图以及Masson染色阳性面积 注：与对照组相比，*P＜0.05

图4 两组小鼠主动脉缩窄术后心脏肥厚的变化情况 A：两组小鼠缩窄术不同时间点后心脏舒张末期直径（LVID，s）的变化，B：两组小鼠术后心脏体质量比，C：两组小鼠术后心脏大体图，D～E：两组小鼠术后心脏组织切片麦胚凝集素染色结果（×200）以及心肌细胞横截面积，注：与对照组相比，*P＜0.05

图5 Western blot检测P-Akt2及Akt2表达水平 A：野生（wt）组；B：糖尿病（dbdb）小鼠组；C：Western blot条带灰度分析图

4.糖尿病促进主动脉缩窄术小鼠的心脏肥厚主动脉缩窄术4周后，心脏肥厚指标左心室收缩末期直径（LVID，s）明显升高，D组与C组比较，D组较C组显著升高，[C组vs.D组：（2.89±0.37）vs.（3.17±0.82），P＜0.05]，有统计学意义。主动脉缩窄术8周后，心脏体质量比D较C组显著升高[C组vs.D组：（4.37±0.67）vs.（6.12±0.32），P＜0.05]，差异有统计学意义，心脏大体图比较发现D组较C组明显增大。WGA染色细胞膜为亮绿色。主动脉缩窄术8周后，D组小鼠心肌细胞面积明显增大，均大于野生C组小鼠[C组vs.D组：（151±21）vs.（223±17），P＜0.05]，差异有统计学意义；A组与B组比较差异均无统计学意义[A组vs.B组：（103±6）vs.（135±3），P＞0.05]。

5.糖尿病对主动脉缩窄术后心力衰竭小鼠akt2表达的影响以往的研究发现akt2可以调节体内葡萄糖的平衡及其缺失可以诱导心脏肥厚为了考察akt2是否参与了糖尿病对主动脉缩窄术后心力衰竭小鼠的影响作用 我们通过蛋白印记检测研究表明，主动脉缩窄术0周及8周后，A组与B组比较发现，B组AKT2磷酸化及AKT2总蛋白表达水平较A组显著降低。

讨论

本研究用糖尿病小鼠构建心力衰竭模型，阐明了糖尿病在主动脉缩窄术诱导小鼠心力衰竭中的作用，糖尿病小鼠可以加重心力衰竭小鼠的心功能（降低心脏射血分数等心功能指数），但不影响心力衰竭小鼠的心率及血压。进一步研究发现糖尿病可以加重心力衰竭小鼠的心脏肥厚、炎症细胞的浸润，初步探讨其机制可能是由于磷酸化AKT2的下调引起的。

既往有文献报道糖尿病是心力衰竭的重要危险因素[7]，其所伴发的高血脂、代谢紊乱会对心血管系统造成不同程度的损害，最终导致患者心脏收缩与舒张功能障碍[8]。葡萄糖是心脏的主要能量来源，血糖异常升高对心脏产生重大影响，HbAlc水平每增加1%，心力衰竭的风险增加8%[9-10]心力衰竭的发展也会促进糖尿病的发生发展，故心力衰竭与糖尿病二者相互促进、互为因果，从而加速病情进展。既往研究表明，HF在糖尿病心血管并发症中发生率及死亡率远高于心肌梗死、卒中、终末期肾病等严重并发症，且糖尿病患者心力衰竭事件的发生率高于普通患者[11]。合并糖尿病的心力衰竭患者每年住院率比未合并者明显增加（从24%～31%），同时糖尿病也增加了患者的死亡风险。对于急性心力衰竭入院的患者，合并糖尿病者死亡率高于未合并者，且血糖水平增高增加患者早期死亡率[12]。本研究发现，主动脉缩窄术8周后，dbdb小鼠的心脏射血分数、缩短分数明显降低，心脏纤维化及炎症浸润面积明显增加，心脏肥厚明显加重。进一步证明糖尿病对心力衰竭的发生、发展起着不可忽视的作用。其次在糖尿病患者中，糖尿病神经病变是最常见的慢性并发症之一，其中心脏自主神经病变发生心血管事件的几率明显增加，心率主要受自主神经的调节[13]，但在本研究中2型糖尿病（dbdb）小鼠在主动脉缩窄术8周后心率没有发生明显变化，此结果可能是由于目前对dbdb小鼠在主动脉缩窄术后心脏自主神经变化的研究尚不完善，因此关于自发性2型糖尿病模型dbdb小鼠复制主动脉缩窄模型对心率的具体影响作用还需进一步研究。

糖尿病发心力衰竭的相关机制包括高血糖与葡萄糖毒性、高血脂与脂毒性、高胰岛素血症和胰岛素对心肌的直接作用、线粒体功能异常、细胞间Ca2+稳态异常、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用等。其中研究最广泛的是是高血糖和葡萄糖毒性[14]。高血糖情况下可以促进蛋白激酶B（AKT）的活性增强[15]。AKT2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族之一，高表达在胰岛素相关组织如脂肪组织、肝、骨骼肌组织，在胰岛素反应性组织中高度活化，且在胰岛素刺激葡萄糖摄取中起关键作用[16]。AKT2可以调节葡萄糖体内平衡并且AKT2缺陷可以导致胰岛素抵抗及表现为糖尿病表型。本研究发现在主动脉缩窄术后的dbdb小鼠较WT小鼠的AKT2表达水平下调，这为糖尿病促进小鼠心力衰竭的发生发展提供了新的研究方向。

综上所述，本研究进一步揭示了糖尿病对心力衰竭过程中心脏结构和功能的作用，为糖尿病和心力衰竭的关系提供了进一步的认识，为临床治疗上提供更多的理论基础，但是心力衰竭与糖尿病二者相互促进的相关机制仍需进一步探究。