细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗体抑制ApoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化形成的实验研究

姚益群 吴勇 申松波 杨浩

动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）是动脉硬化血管病中最常见、最重要的一种，是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因[1-2]。As的特点是其所受累动脉的病变开始于内膜，先后合并有多种病变，包括局部脂质及复合糖类积聚、纤维组织增生以及钙质沉着而导致斑块形成，并渐发生动脉中层退变，其继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂以及局部血栓形成。病变常常累及大、中肌性动脉，一旦发展到其体积足以阻塞动脉管腔，则会导致该所受累动脉所供应的组织或者器官的缺血或坏死[3-4]。在As发生及发展过程中，有着多种危险因素的参与，然而在这诸多危险因素中，高脂血症占首要地位。血脂中的TG，LDL-C水平是判断As的最佳标志[5]。目前针对As所导致的心脑血管疾病的抑制与治疗尚未找到有效预防及治疗手段，现急需寻找一种安全有效，无不良反应并具有良好的社会学效益，且能有效缓解As患者体内血脂代谢紊乱，降低As等血管并发症发病率的新型药物，具有重要的临床意义。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN），属于免疫球蛋白超家族成员之一，多见于肿瘤细胞表面，可使肿瘤细胞迁移、浸润[6]。有研究表明，EMMPRIN在As斑块内表达较高，并参与了As病变的发展[7]。进来的研究表明，EMMPRIN参与As斑块的破裂[8]。本研究构建ApoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化模型，探究EMMPRIN对ApoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化的作用，为临床上动脉粥样硬化治疗提供思路与方法。

材料与方法

1.实验动物 6～8周龄，ApoE基因缺失（ApoE（-/-））雄性，小鼠30只（体质量25～33 g），由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。6～8周龄雄性，C57BL/6 J小鼠10只（体质量46～59 g），由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

2.方法 （1）建立AS模型：本实验采用8周龄，SPF级雄性，C57BL/6 J小鼠10只和ApoE（-/-）小鼠30只，体质量（25±3）g，购于北京华阜康生物科技服份有限公司，批号11401300014365。置于室温为（22±2）℃，湿度为（60±5）%，自然光照条件下，自由取食饮水。饲以高脂饲料（含21%脂肪和0.15%胆固醇），诱导构建As动物模型，模型成功率80%。

（2）实验分组及给药方法：将小鼠置于实验动物标准条件下饲养，随机分为四组，每笼4～5只小鼠，具体分组情况如下：Ⓐ：空白对照组：雄性C57BL/6 J小鼠10只，普通饲料喂养。Ⓑ：ApoE（-/-）阴性对照组：ApoE（-/-）小鼠10只，普通饲料喂养。Ⓒ：ApoE（-/-）阴性AS组：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂饲料喂养。Ⓓ：EMMPRIN单克隆抗体干预组：ApoE（-/-）小鼠10只，高脂饲料喂养，在高脂喂养12周成功诱导出小鼠As后给予100ug EMMPRIN单克隆抗体腹腔注射。所有小鼠适应性喂养1周后，每周2次于08:00～10:00时按上述浓度给药处理，连续给药8周。

（3）标本采集：一般指标：给药期间观察并记录各组小鼠的体质量、摄食量、外观体征、行为活动、毛发状态，精神状态和死亡情况。

（4）血液标本采集：治疗结束第2天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，经心脏取血1～2 mL，生化采血管收集。静置3 h，4 000rpm离心取血清，4℃保存。

（5）组织标本采集：取血后，每组取10只，摘取小鼠主动脉组织，液氮速冻后，-80℃保存，留待后续实验备用。其余小鼠，摘取主动脉后置于4℃预冷的4%多聚甲醛溶液中固定保存。

（6）冷冻切片的制备：取4%多聚甲醛固定的组织，依次置于20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液，4℃静置梯度脱水。脱水完全的组织，采用OCT包埋剂包埋，置于液氮快速冷冻，冷冻切片机连续切片，厚度为10μm，自然晾干后4℃保存。

3.检测指标和实验方法 （1）血清生化指标检测：采用全自动生化分析仪（CX-7，Beckman）分析下列血液生化指标：TC、TG、氧化低密度脂蛋白、LDIC、HDL-C，载脂蛋白A、B和E，并计算血脂As指数和体脂含量。

（2）实时荧光定量PCR检测：摘取小鼠主动脉组织加入1 mL的Trizol RNA iso（Takara，日本），经研磨棒充分研磨后，提取总RNA，检测总RNA的纯度，在1.9～2.0的范围，利用逆转录试剂盒进行反转录cDNA，4℃保存，采用20μL反应体系进行荧光定量PCR检测。采用FS 2000系统进行分析，反应条件为：95℃30 s。PCR：95℃5s；60℃30 s，40个循环。溶解曲线：95℃5s；60℃1min。降温：50℃30 s，1个循环。内参基因GAPDH、FGP-2和VEGF的引物由上海生工公司设计（表1）。采用2-△△CT的方法计算相对表达量。

表1 目的基因的引物序列

（3）Western-blot检测：摘取小鼠主动脉组织1 mg，加入1 mL RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min，收集入1.5 mL离心管，在4℃离心机中离心，预设：5 000 r/min，5 min后提取上清，后95℃煮沸，4℃保存。按照说明书制备浓缩胶10 mL，分离胶20 mL。上样后电泳分离，转膜，FGP-2和VEGF的一抗经一抗稀释液1:10 000稀释后加入样本离子膜，4℃冰箱避光孵育过夜（＞12 h），PBST洗膜，5 min，重复3次，用山羊抗小鼠IgG二抗经稀释液1:1 000稀释后孵育1.5 h，PBST洗膜5 min，重复3次，用DAB显影液处理样本。Image J软件分析蛋白条带。

（4）免疫组化染色：按照中杉金桥超敏二步法试剂盒的说明书对冷冻切片进行操作。加入一抗（VEGF）4℃孵育过夜，TBS漂洗后加入链霉亲和生物素辣根酶（SABC）标记二抗，37℃孵育20 min，DAB显色，阳性细胞呈棕黄色。光学显微下观察，每张切片随机取五个视野，对阳性细胞计数，取其均值。以阳性细胞指数（阳性细胞数/细胞总数）表示蛋白表达水平。

4.统计学方法 应用SPSS统计软件19.0版本进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，四组的比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK法检测。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.各组血清生化指标的检测结果 在血清学生化指标中的TG、TC、HDL-C、LDL-C的比较中，ApoE（-/-）AS模型组与ApoE（-/-）阴性对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。EMMPRIN单克隆抗体干预组与ApoE（-/-）AS模型组的比较中，在TG、TC、LDL-C等指标中，EMMPRIN单克隆抗体干预组明显低于ApoE（-/-）AS模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。EMMPRIN单克隆抗体干预组的HDL-C均高于AS模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在生化指标中的载脂蛋白A1和载脂蛋白B的比较中，ApoE（-/-）AS模型组与ApoE（-/-）阴性对照组相比，均差异有统计学意义（P＜0.05）。EMMPRIN单克隆抗体干预组与ApoE（-/-）AS模型组相比，均差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.RT-PCR和Western blot检测结果 RT-PCR和Western blot结果显示：AS模型组中VEGF蛋白表达量明显大于空白对照组（P＜0.05）；阴性对照组中主动脉VEGF蛋白表达量与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；EMMPRIN单克隆抗体干预组中主动脉VEGF蛋白表达量明显降低，与AS模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组血清生化指标检测结果比较（，n=40）

表1 各组血清生化指标检测结果比较（，n=40）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与ApoE（-/-）AS模型组比较，#P＜0.05

项目 空白对照组 EMMPRIN单克隆抗体干预组ApoE（-/-）AS模型组ApoE（-/-）阴性对照组例数 10 10 10 10 TG 2.532±0.784 1.613±0.323# 2.324±1.014* 1.796±0.944#TC 3.865±1.315 22.867±5.314*23.461±9.667* 10.666±6.114#HDL 1.256±0.174 4.027±1.645*#3.184±0.949*#2.324±0.951#LDL 0.584±0.124 6.119±2.894* 6.273±2.119* 3.929±0.917#ApoA1 0.010±0.007 0.007±0.001 0.008±0.005 0.001±0.004 ApoB 0.028±0.014 0.028±0.009 0.022±0.017 0.054±0.037

3.各组免疫组织化学分析结果 免疫组化显示，棕黄色阳性颗粒主要表达在模型小鼠主动脉内皮细胞的细胞膜上。空白对照组均未见明显的VEGF蛋白的表达。ApoE（-/-）AS模型组中VEGF蛋白表达量明显大于空白对照组（P＜0.05）；ApoE（-/-）阴性对照组中主动脉VEGF蛋白表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＞0.05）；EMMPRIN单克隆抗体干预组中主动脉VEGF蛋白表达量明显降低，与As模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 FGP-2的mRNA相对表达量 图2 VEGF的mRNA相对表达量 图3 FGP-2和VEGF蛋白的表达量 A：空白对照组，B：ApoE（-/-）阴性AS组，C：ApoE（-/-）阴性对照组，D：EMMPRIN单克隆抗体干预组

图2 免疫组织化学分析的结果（400X）

讨论

动脉粥样硬化是个逐渐变化的过程，始于内皮细胞的病变，然后伴随脂质沉积、炎症细胞浸润等密切相关[9-11]。本文就EMMPRIN单克隆抗体对于As的作用机制，以及探讨是否作用于细胞的内质网应激机制[12-15]。根据预实验结果选择100μg EMMPRIN单克隆抗体腹腔注射给药。

TG、TC、HDL-C、LDL-C，是导致As和各种心脑血管疾病的首要因素[16]。最近研究认为，LDL-C是唯一能将胆固醇带入血管壁内皮细胞的脂蛋白，是促进As斑块形成的关键物质。本研究通过检测TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量来验证造模的成功与否，结果显示，ApoE（-/-）AS组与ApoE（-/-）阴性对照组相比，均差异有统计学意义（P＜0.05），证明了实验As模型构建成功。另外，本研究还以TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量变化来检测EMMPRIN单克隆抗体对As的治疗作用，结果显示EMMPRIN单克隆抗体治疗组中TG、TC、LDL-C等明显低于ApoE（-/-）AS组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明EMMPRIN单克隆抗体对As的发展进程具有明显的抑制与治疗作用。EMMPRIN单克隆抗体治疗组的HDL-C均高于AS模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明EMMPRIN单克隆抗体对于以HDL-C升高为主的高脂血症与As同样具有一定的抑制与治疗作用。ApoE（-/-）AS组与ApoE（-/-）阴性对照组生化指标中的载脂蛋白A1和载脂蛋白B的比较，均差异有统计学意义（P＜0.05），进一步说明了本实验As的构建成功。而EMMPRIN单克隆抗体对于As具有明显的抑制作用。

为探究EMMPRIN单克隆抗体在As的机制中是否与内质网应激[17]相关，本研究采用RT-PCR、Western-Blot和免疫组化等半定量的实验方法，比较内质网应激标志蛋白VEGF蛋白[18]和FGP-2蛋白[19]以上四组细胞中的表达量。空白对照组均未见明显的VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表达。EMMPRIN单克隆抗体治疗组中主动脉VEGF蛋白表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＞0.05），说明EMMPRIN单克隆抗体可以抑制VEGF蛋白的表达，从而证明EMMPRIN单克隆抗体可以通过内质网应激标志蛋白VEGF和FGP-2蛋白作用于动脉的内皮细胞，从而抑制As。

综上所述，EMMPRIN单克隆抗体通过抑制内质网应激VEGF蛋白和FGP-2蛋白的表达发挥其抑制As的作用。