云南甘蔗白条病的多基因联合鉴定

张荣跃 李文凤 王晓燕 单红丽 仓晓燕

摘要甘蔗白条病是由白条黄单胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害。2017年在云南保山、孟定和金平蔗区的甘蔗上发现疑似白条病的病害。从病株蔗茎中分离得到圆形，凸面，光滑，有光泽，黄色的细菌菌落。经柯赫氏法则验证，分离得到的细菌为该病害的病原菌。使用16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因对分离得到的病原菌进行了分子鉴定，BLAST和系统发育分析表明本研究所获得的病原菌的3个基因的核苷酸序列与白条黄单胞菌GPE PC73菌株（GenBank登录号： FP565176）对应基因的核苷酸序列一致性均为100%，在系统发育树中处于同一分支。根据田间症状诊断、柯赫氏法则验证及分子鉴定结果，确认云南保山、孟定和金平发生的甘蔗病害为X. albilineans引起的甘蔗白条病。

关键词甘蔗白条病;白条黄单胞菌;系统发育分析;云南

中图分类号：S 432.42

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018178

甘蔗白条病是由白条黄单胞菌Xanthomonas albilineans （Ashby） Dowson引起的甘蔗重要病害之一，其對甘蔗的危害是毁灭性的，常造成巨大的经济损失[12]。该病害于19世纪20年代在印度尼西亚爪哇岛、澳大利亚和斐济被首次报道，现已广泛发生于美国、古巴、巴西、澳大利亚、法国、印度和巴基斯坦等40多个植蔗国家和地区[3]。2016年在我国广西蔗区首次检测到甘蔗白条病[4]。甘蔗白条病是一种细菌性维管束病害，可通过带病蔗种进行远距离传播，在田间还可通过刀具和收获工具等机械传播，也可通过气流和雨水传播，且传播性极强[56]。X. albilineans目前仍是中国进境植物重要的检疫对象之一[7]。

目前，除云南外，在广西、广东、海南、福建均发现了甘蔗白条病[8]。2017年在云南保山、孟定和金平蔗区的甘蔗上发现了疑似白条病的病害。为明确这些病害是否是由X. albilineans引起的甘蔗白条病，本文采用了病害田间症状观察、柯赫氏法则验证，同时结合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因序列分析对病原进行了鉴定，旨在为该病害的防控和研究提供参考。

1材料与方法

1.1甘蔗白条病样品

2017年从云南孟定、保山和金平蔗区采集18份疑似甘蔗白条病样品，MD1S～MD7S来自孟定，品种为‘柳城031137;BSH1S～BSH5S来自保山，品种为‘桂糖081589;JP1S～JP6S 来自金平，品种为‘ROC1。

1.2病原分离培养及回接试验

将蔗茎用无菌水清洗干净，切成5～8 cm，使用75%乙醇溶液表面消毒20 s，然后点火将蔗茎表面乙醇溶液烧尽，连续进行2次。将蔗茎放入灭菌的50 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，吸取离心管底部蔗汁，使用1×PBS缓冲液按10-1～10-8进行梯度稀释，每个梯度稀释液吸取50 μL在琼脂MW培养基进行涂板。琼脂MW培养基配方参照Davis 等[9]，培养基pH6.8～7.0。配制培养基的所有试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。28℃培养6～8 d后，挑取单菌落进行纯化培养。收集纯培养的菌体，用蒸馏水配制成1×108 cfu/mL接种悬浮液，对温室种植的甘蔗进行人工接种，接种方法参照Rott等[10]的方法。以无菌水处理作对照，观察病害发生发展情况，并对接种后发病的植株进行病原菌再分离。

1.3菌株DNA提取

将纯化培养的菌株分别转接至2 mL MW液体培养基中，于28℃、200 r/min条件下培养7 d，12 000 r/min离心收集菌体，弃上清，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA。DNA提取步骤参照试剂盒说明书。

1.4多位点基因序列扩增

扩增X. albilineans的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的引物参考文献[11]，引物序列见表1。25 μL扩增反应体系包括ddH2O 10.5 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、DNA 模板1.0 μL、上、下游引物各0.5 μL （20 μg/μL）。PCR扩增程序为： 95℃预变性5 min; 94℃变性1 min，55℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 25个循环; 72℃延伸10 min。取10 μL扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.5PCR产物克隆、测序及序列分析

使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR产物目的片段，并将其与pEASYT5（北京全式金生物技术有限公司）进行连接转化，每个转化挑选6个阳性克隆送华大基因测序。测序结果使用BLAST进行对比。使用DNAMAN V 6.0进行序列一致性分析。运用MEGA V 6.0软件构建系统进化树[12]，采用neighborjoining法建树，模式选择Kimura 2parameter，自举检测（bootstrap）重复1 000 次。

2结果与分析

2.1田间症状观察

2017年在云南保山、孟定和金平蔗区的甘蔗上观察到疑似白条病的病害。病害症状主要表现为叶片上产生白色条纹，沿维管束伸展，有的叶片大面积白化。染病较重的病株蔗茎节间变短，叶片短直，茎的节部长出许多侧芽和细小的分蘖，分蘖的叶片上也出现上述的白色条纹 （图1a）。

2.2柯赫氏法则验证

从保山、孟定和金平采集的蔗茎样品中均分离得到圆形，凸面，光滑，有光泽，黄色的细菌菌落 （图1b）。对分离到的菌株进行回接验证，接种20 d后，接种甘蔗植株的叶片上出现了白色条纹，新发出的叶片叶尖白化，症状与田间发病症状相似 （图1c）。对照甘蔗没有观察到任何症状。从接种发病的蔗茎中重新分离得到了相同的黄色菌落。经柯赫氏法则验证，从蔗茎中分离得到的该细菌为甘蔗白条病的病原菌。

2.3病原菌的多基因联合鉴定

本研究测定了获得的所有菌株的16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因的部分序列（表2）。结果表明，来自云南孟定、保山和金平的18个菌株的这3个基因的核苷酸序列一致性均为100%，与X. albilineans菌株GPE PC73菌株 （GenBank登录号： FP565176） 的3个基因的核苷酸序列一致性也均为100%。分别使用这3个基因序列与黄单胞菌属的其他种构建了系统发育树 （图2～4）。在基于16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因构建的3个系统发育树中，本研究所获得的菌株与X. albilineans菌株均处于同一分支，明显区分于黄单胞菌属的其他种，表明本研究获得的病原菌与X. albilineans亲缘关系最近。

3结论与讨论

甘蔗白条病是由X. albilineans引起的甘蔗重要病害。本研究通过对采自云南保山、孟定和金平蔗区的疑似白条病病株进行病原菌分离纯化，柯赫氏法则验证，并结合16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因部分序列对分离得到的菌株进行了分子鉴定，最终确定云南保山、孟定和金平蔗区发生的病害为X.albilineans引起的甘蔗白条病。本研究可为中国今后开展甘蔗白条病的深入研究和科学有效防控奠定基础和提供参考依据。

甘蔗白条病是一种易随种苗传播的危险性病害，对甘蔗生产和发展有潜在的威胁。本研究采集的样品均來自各蔗区的甘蔗新品种和良种繁育基地，因此，有必要加强对良繁基地扩繁种苗和引进及外调甘蔗的白条黄单胞菌的检疫和监测，从源头上控制白条黄单胞菌扩散蔓延，确保甘蔗安全生产和蔗糖产业可持续发展。另外，今后在加强白条病检疫和监测的同时，应加强甘蔗白条病优良抗源材料和抗病品种的评价筛选，为选育和利用抗病品种有效防控甘蔗白条病提供优良抗源材料。

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（责任编辑：杨明丽）