贵港报春苣苔的叶片组培与植株再生

闫海霞 黄昌艳 张自斌 崔学强 邓杰玲 关世凯 卜朝阳

摘  要  以貴港报春苣苔的叶片为外植体，研究不同培养基对其不定芽诱导和增殖、愈伤组织诱导与分化以及生根的影响。结果表明，外植体叶片以纵切为宜，不定芽诱导最适培养基为MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L，愈伤组织诱导最适培养基为MS+6-BA 3.0～5.0 mg/L+2，4-D 0.5～1.0 mg/L，不定芽诱导率以及愈伤组织诱导率均为100.00%;愈伤在MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培养基上分化系数达12.64;不定芽在MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L培养基的增殖系数为8.55;不定芽在3/4 MS+NAA 0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L培养基上的生根率为100.00%。综上所述，叶片纵切后能通过不定芽途径以及愈伤组织途径建立贵港报春苣苔的组织培养技术体系，在该体系下不定芽增殖系数高、愈伤分化高，组培苗生根好。

关键词  贵港报春苣苔;组织培养;再生体系;天然提取物中图分类号  S68      文献标识码  A

Tissue Culture and Plant Regeneration of Leaves of Primulina guigangensis

YAN Haixia， HUANG Changyan， ZHANG Zibin， CUI Xueqiang， DENG Jieling， GUAN Shikai， BU Zhaoyang^*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract  The effects of different media on the primary induction， adventitious buds proliferation， callus differentiation and rooting culture were investigated using the leaves of P. guigangensisas the explants. The results showed that the rip cutting was the suitable method; the suitable medium for adventitious buds regeneration was MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L; the suitable medium for callus induction was MS+6-BA 3.0–5.0 mg/L+2，4-D 0.5–1.5 mg/L; both rate of adventitious buds induction and rate of callus induction were 100.00%; the suitable medium for callus differentiation was MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the differentiation coefficient was 12.64; the suitable medium for adventitious buds proliferation was MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+potato 30 g/L+banana 30 g/L+apple 20 g/L+coconut juice 100 mL/L， and the multiplication coefficient was 8.55; the suitable medium for rooting culture was 3/4 MS+NAA 0.01–0.05 mg/L+active carbon 1.0–3.0 g/L and the rooting rate was 100%. It was concluded that the leaves rip cutting could be used to establish the tissue culture system ofP. guigangensisby the regeneration methods of adventitious buds and callus which had high induction and proliferation rates of adventitious buds and good rooting growth.

Keywords  Primulina guigangensis; tissue culture; regeneration system; natural extracts

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.015

贵港报春苣苔（Primulina guigangensis）为苦苣苔科報春苣苔属的多年生草本植物。该种于2011年在广西贵港市樟木镇海拔约160 m的石灰岩山区首次发现^[1]。其对环境的要求较苛刻，生态位极为狭小，种群数量正在逐渐减少，因此开展物种保护的研究十分必要，对其进行人工繁殖研究获得种苗能用于迁地保护和自然回归。贵港报春苣苔可用种子播种和叶片扦插繁殖2种方式，种子繁殖常受种源及发芽率的影响，叶片扦插繁殖所需时间长，繁殖系数小，而组培快繁具有周期短、易成规模、繁殖后代品质优良的优点，是人工繁殖的有效途径之一。该技术目前在报春苣苔属的其他植物上已有相关报道，且逐年增多^[2-12]。但贵港报春苣苔的组培快繁技术未见相关报道。因此，建立贵港报春苣苔的组培快繁体系，对进一步保护和利用该物种具有十分重要的意义。

报春苣苔属植物多数没有分枝，也没有明显的地上茎，贵港报春苣苔也具有该属的这一典型特征;此外，花朵、种子等器官又都受季节条件的限制，尤其种子极细小，采收烦琐，而叶片取材容易，对母株的伤害极小，是理想的外植体类型。故本研究以贵港报春苣苔的叶片为外植体，对初代培养、增殖培养、生根培养的适宜培养基以及移栽关键技术进行探讨，以期建立离体快繁体系，为其今后的遗传转化以及报春苣苔属的野生花卉资源的保护和利用研究提供理论基础。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  植物材料  贵港报春苣苔于2015年12月引种，并在广西壮族自治区农业科学院花卉研究所观赏植物研发中心人工驯化6个月，生长健壮、无病虫害（图1A，图1B）。实验于2016年8月—2017年7月开展。

1.1.2  培养基及培养条件  基本培养基为MS、1/2 MS、1/4 MS和3/4 MS。MS培养基中的白砂糖为30 g/L，琼脂为6 g/L，pH 5.4～5.8;1/2 MS培养基的大量元素和白砂糖含量为MS培养基中的1/2，其余成分的含量和MS培养基相同;1/4 MS培养基的大量元素和白砂糖含量为MS培养基中的1/4，其余成分的含量和MS培养基相同;3/4 MS培养基的大量元素和白砂糖含量为MS培养基中的3/4，其余成分的含量和MS培养基相同。

培养基中添加的植物生长调节剂有6-糠氨基嘌呤（激动素，KT）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）。

培养条件：温度（25±1） ℃，光照强度2000 lx，光照时间12～14 h/d。

1.2方法

1.2.1  外植体的处理与初代诱导  取贵港报春苣苔幼嫩叶片，在流水下冲洗10～15 min后，在超净工作台上先用棉球蘸取75%酒精拭擦叶片表面，无菌蒸馏水冲洗5次，然后将叶片在75%酒精中浸泡10 s，无菌蒸馏水冲洗5次，再用0.1%升汞（加数滴吐温-20）浸泡8 min，无菌蒸馏水冲洗5次。将灭菌好的叶片按如下方法切割：横切（垂直中脉在叶片中间切割，图1C）、纵切（沿着叶片中脉切割，图1D），同时切去叶片四周少许组织，保证四周均有伤口。然后将横切叶片、纵切叶片接入初代培养基中，叶片正面朝上，叶背朝下。培养40 d，观察叶片诱导情况并记录，计算诱导率。不定芽以具有1对以上叶片的组培芽计（以下同）。

1.2.2  愈伤组织分化  （1）不同植物生长调节剂。在仅附加了KT、NAA这2种植物生长调节剂的培养基中进行分化培养。

（2）不同种类、不同含量天然提取物对愈伤组织分化的影响。在（1）筛选出来的培养基上添加不同种类、不同含量的天然提取物，以此为培养基进行分化培养。

（3）不同天然提取物组合对愈伤组织分化的影响。将（2）筛选出来的培养基进行不同天然提取物的组合，以此为培养基进行分化培养。

本节中的目标培养物均为从叶片诱导出来的愈伤组织，切成1 cm×1 cm大小接入分化培养基中，培养30 d，培养期间每隔3 d观察培养情况，30 d后统计新产生的不定芽数，计算分化系数。

1.2.3  增殖培养  方法参照1.2.2节，目标培养物为具有1对以上叶片的不定芽，培养30 d，培养期间每隔3 d观察培养情况，30 d后统计新产生的不定芽数，计算增殖系数。

1.2.4  生根培养  （1）基本培养基的筛选。选取生长健壮，具有2对以上叶片的植株，转接于不同的基本培养基中。

（2）附加植物生长调节剂培养基的筛选。在（1）筛选出来的培养基上添加不同植物生长调节剂，以此为培养基进行生根培养。培养40 d后，统计生根数、主根数量、生根时间，计算生根率。

1.2.5  移栽  选取具有2对以上叶片、根数较多、

根长适中的组培瓶苗置于温室大棚中先带盖炼苗7 d，然后揭盖炼苗3 d，取出洗净基部培养基再进行移栽。基质采用泥炭混合珍珠岩，体积比为2∶1。移栽后置于遮阴通风处，保持基质湿润。移栽组培苗100株，20 d后统计移栽成活率。

1.2.6  测定指标的计算  不定芽诱导率=产生不定芽的叶片数/接种叶片数×100%;愈伤诱导率=产生愈伤组织的叶片数/接种叶片数×100%;分化系数=新不定芽数/接种愈伤数;增殖系数=新不定芽数/接种不定芽数;生根率=生根数/接种数× 100%。

1.3数据处理

各培养阶段的实验处理材料数为100个，进行3次重复，数据均为3次重复的平均值。采用Excel 2003、SPSS 19.0等软件对数据进行统计与处理，其中多重比较采用Duncans方法。

2  结果与分析

2.1初代诱导

由表1可知，切割方式相同的各处理之间，IAA处理组的不定芽诱导率显著高于2，4-D处理组的不定芽诱导率（该值为0），但2，4-D处理组的愈伤诱导率显著高于IAA处理组的愈伤诱导率（该值为0）。即不论切割方式如何，添加了IAA的培养基可诱导产生不定芽，但不能诱导产生愈伤组织，而添加了2，4-D的培养基则可诱导产生愈伤组织，不能诱导产生不定芽。当培养基附加的植物生长调节剂相同时，纵切的不定芽诱导率以及愈伤诱导率均显著高于横切的。此外，处理2的纵切叶片在MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L培养基上培养时，获得的不定芽数显著高于其他处理，但其诱导时间和其他处理间无显著差异。由此可知，虽然叶片纵切、横切均可直接诱导出不定芽（图1E）和愈伤组织（图1F）。但在30 d的培养时间内，从愈伤组织并未分化出不定芽。因此，叶片以纵切为宜，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 3.0～5.0 mg/L+2，4-D 0.5～1.5 mg/L，不定芽诱导率以及愈伤组织诱导率均为100.00%。

2.2愈伤组织分化

通过表2的方差分析可得，在培养基上附加KT和NAA，随着浓度的变化，分化系数有所差异。当KT浓度相同时，随NAA浓度增加，分化系数先上升后下降;其中KT浓度为0.5和1.0 mg/L时，随NAA浓度增加，分化系数的上升和下降都有显著差异;KT濃度为1.5 mg/L时，随NAA浓度增加，分化系数上升有显著差异，但下降差异不显著。当NAA浓度相同时，随KT浓度的增加，分化系数的变化不同;NAA浓度为0.1 mg/L时，分化系数有上升的趋势;NAA浓度为0.2、0.3 mg/L时，分化系数呈先上升后下降的趋势，但前者变化显著，后者的下降变化无显著差异。由此表明，附加适宜浓度的植物生长调节剂对愈伤的分化以及生长有利，其中，在培养基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，分化系数最高，获得的芽多，极少玻璃化，不定芽长势健壮（图1G），是适宜的分化培养基。

通过表3可以看出，与对照Y₅相比，添加了天然提取物的分化系数因种类、含量不同而不同。随着提取物含量的增加，分化系数均呈先上升后下降的趋势，但不同提取物的分化系数的变化略有差异。当添加土豆或椰汁时，随着含量增加，分化系数的变化存在显著差异;在土豆含量为30 g/L、椰汁含量为100 mL/L时，分化系数分别为该附加物的最大值。当添加香蕉时，随着含量增加，分化系数的变化在下降后差异显著，含量为30 g/L时的分化系数最高。当添加苹果时，随着含量的增加，分化系数的上升存在显著差异，下降后分化系数的变化无显著差异，当苹果含量为20 g/L时，分化系数达到最大值。由此可知，培养基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上分别添加土豆30 g/L、香蕉30 g/L、苹果20 g/L、椰汁100 mL/L，有利于愈伤的分化，获得不定芽多，无玻璃化，不定芽长势健壮。

通过对表4进行方差分析可知，在植物生长调节剂KT为1.0 mg/L以及NAA为0.2 mg/L的条件下，培养基中添加了天然提取物的分化系数显著高于未添加提取物的分化系数，并且添加了4种天然提取物的分化系数（12.64）显著高于添加2或3种提取物的培养基的分化系数，培养基中添加了2种天然提取物的分化系数显著低于添加了3种的。此外，添加了天然提取物的所有处理，其愈伤组织的分化情况均表现为不定芽多，无玻璃化，不定芽的长势健壮。因此，适宜的愈伤分化培养基为MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20 g/L+椰汁100 mL/L，分化系数达12.64，植株长势好，健壮（图1H）。

2.3不定芽的增殖培养

由表5可知，当ZT（或NAA）浓度相同时，随着NAA（或ZT）浓度的增加，增殖系数呈现增加后降低的趋势。其中，当NAA浓度为0.5和1.0 mg/L时，增殖系数随ZT浓度的增加先显著增加后显著降低，而浓度为0.15 mg/L时，增殖系数的变化不显著;当ZT浓度为0.5和1.5 mg/L时，增殖系数显著增加，而降低则不显著，浓度为1.0 mg/L时的增加以及降低的变化都有显著差异。培养基J₅即MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L的增殖系数最高，和其他培养基有显著差异，在此培养基上的芽点多且极少玻璃化，不定芽长势优，是适宜的基本培养基（图1I）。

由表6可知，与对照培养基MS+ZT 1.0 mg/L+ NAA 0.10 mg/L相比，附加不同种类和含量的天然提取物，其增殖系数有所增加也有所降低。添加土豆和香蕉，随着含量的增加，增殖系数呈现先显著增加后显著下降的趋势，30 g/L时的增殖系数最高，芽点多，无玻璃化，不定芽长势优。添加苹果和椰汁，随着含量增加，其增殖系数亦呈先上升后下降的趋势，其中添加苹果后的增殖系数升降均显著，但在下降到一定数值后变化不再显著，在20 g/L时的增殖系数最大;添加椰汁的增殖系数上升不显著，在100 mL/L时达最大值，在150 mL/L以后的增殖系数变化不显著。由此表明，在培养基MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L上分别添加土豆30 g/L、香蕉30 g/L、苹果20 g/L、椰汁100 mL/L时，增殖系数均为添加同种提取物时的最大值，是适宜的添加量，有利于增殖。

通过对表7的方差分析可知，附加了提取物的培养基的增殖系数显著高于对照的增殖系数，并且随着天然提取物种类数量的增加，增殖系数呈上升趋势。添加2种的增殖系数显著低于3种、4种的，添加3种的增殖系数显著低于4种的，即培养基MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20 g/L+椰汁100 mL/L的增殖系数（8.55）显著高于其他培养基。因此，培养基MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20 g/L+椰汁100 mL/L是不定芽增殖的适宜培养基，增殖系数为8.55，芽点多，无玻璃化，不定芽长势优（图1J）。

2.4生根培養

由表8可知，MS培养基的生根率、平均根数显著低于其他3种培养基，1/2 MS、1/4 MS、3/4 MS培养基的生根率无显著差异，但平均根数差异达显著水平，其中3/4 MS培养基平均根数显著高于其他培养基，且其生根时间显著少于其他培养基。因此，培养基3/4 MS适宜作生根培养的基本培养基，在此培养基上植株生长健壮，叶片浓绿，根系多，根无愈伤组织。

由表9分析可得，培养基的生根率均为100.00%，无显著差异。但NAA和活性炭的含量不同，平均根数和生根时间也有所不同。当NAA浓度相同时，随活性炭含量的增加，平均根数先增加后降低。其中NAA浓度大于0.3 mg/L时，平均根数、生根时间无显著差异;当NAA为0.1 mg/L时，生根时间差异不显著。由此可得，适宜生根的培养基为3/4 MS+NAA 0.01～0.05 mg/L+活性炭1.0～3.0 g/L，生根率为100.00%，根系发达，植株健壮（图1K）。

2.5移栽

移栽后的组培苗放在温度为15～30 ℃，空气湿度为90%以上，光照2000～4000 lx的环境中，并保持基质湿润。20 d后，成活率可达100.00%（图1L）。

3  讨论

多数报春苣苔属植物没有分枝，也没有明显的地上茎，而花朵、种子等器官又受季节条件的限制，故茎段、花朵、种子均不适宜作为外植体，而叶片取材容易，对母株的伤害极小，是理想的外植体类型。现有的报春苣苔属植物的组培快繁研究多以叶片为外植体，但对叶片的处理方式没有进行深入研究。本研究对叶片进行横切、纵切后，平铺插入培养基中，结果得出不同的叶片切割方式对初代诱导的影响不同，纵切的不定芽诱导率以及愈伤诱导率均显著高于横切的，纵切获得的不定芽数量较多。叶片切割方式不同，产生的不定芽数量不同，这一观点在叶插繁殖中已获证明。如疏花报春苣苔、百寿报春苣苔和王氏报春苣苔采用全叶插（不切割）、1/2或1/3下段方式扦插获得的子株少，中上段扦插获得的子株多^[13]。蚂蟥七、牛耳朵和尖萼唇柱苣苔以横切两段式叶插，上半部分形成子株最多，而全叶插和两段式叶插的下半部分形成子株较少^[14]，原因是全叶插和两段式叶插的下半部分带叶柄叶片，因只有叶柄能接触基质，因此形成子株数量较少，而两段式叶插的上半部不仅能在切断的主脉处形成子株，在次级较粗侧脉亦能形成子株，因此形成子株数量多。但弄岗报春苣苔同样采用了全叶插和两段式叶插的扦插方式，却发现叶片横切两段式的上部分获得的子株较全叶插和两段式叶插的下半部分子株少^[15]，具体原因还有待于进一步研究。本研究规避了叶片接触培养基不均的问题，以平铺的方式接触培养基。结果表明，纵切的不定芽诱导率以及愈伤诱导率均显著高于横切的，纵切获得不定芽显著高于横切的。原因可能是，一方面叶脉部分薄壁细胞多，运输营养物质的能力强;另一方面不定芽多数是从伤口处发生，而纵切中带伤口叶脉接触的培养基面积大，横切仅有部分带伤口叶脉接触培养基。因此，叶片纵切形成的不定芽多^[16]。

天然提取物一般从植物材料中提取，有效成分为氨基酸、酶、植物激素。本研究采用了4种天然提取物：土豆、香蕉、苹果、椰汁。此类提取物常用于兰花的组培研究中，如在基本培养基中添加适当的香蕉泥、椰乳可在一定程度上促进蝴蝶兰原球茎的增殖^[17]，添加10%马铃薯汁有利于铁皮石斛原球茎的增殖和芽的分化^[18]，添加土豆汁对文心兰的增殖具有促进效果^[19]，添加香蕉汁更有利于原球茎的分化和组培苗生根^[20]。而在苦苣苔科植物的组培中并未见相关报道。本研究采用这4种天然提取物，研究了单一使用以及组合使用对不定芽增殖以及愈伤组织分化的影响，结果得出，单一添加土豆30 g/L、香蕉30 g/L、苹果20 g/L、椰汁100 mL/L时，增殖系数、分化系数均为添加同种附加物时的最大值;组合添加时，添加4种的分化系数显著高于添加2、3种的，添加2种附加物的分化系数显著低于添加了3种附加物的分化系数，这和张超等^[21]的观点是一致的：将2～3种有机附加物进行组合添加，效果常优于单独添加，原因可能是不同有机附加物组合的营养成分更为丰富。

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