四氮唑杂合体的抗真菌活性

刘兰 编写，黄敏 审校

(武汉大学医学职业技术学院，武汉 430060)

1 前言

据2018年统计，据统计，每年约有3亿人罹患侵袭性真菌感染(IFIs)，超百万人因此丧命。唑类抗真菌药物如酮康唑、伊曲康唑和氟康唑等对真菌感染的防治不可或缺，但大多存在耐药性和毒副作用等问题。因此，开发新型抗真菌药物势在必行。四氮唑是羧酸的生物电子等排体，其衍生物具有抗菌、抗肿瘤、抗老年痴呆、抗结核、抗疟疾和抗真菌等多种生物活性，且某些临床上使用的药物如西洛他唑、头孢唑林、头孢羟唑和厄贝沙坦等均含有四氮唑结构单元。显然，四氮唑在新药研发领域占据重要位置。

杂合体具有降低毒副作用、提高活性和拓展生物活性谱的潜力，是近年来新药研发的热点。四氮唑类化合物具有潜在的抗真菌活性，故如将四氮唑与其它抗真菌药效团杂合可能会进一步提高这类化合物的活性。近年来，药物化学家设计合成了多个系列四氮唑杂合体，并评价了它们的体内外抗真菌活性。本文将重点介绍该领域的最新研究进展，并归纳构-效关系(SAR)，以期进一步指导科学家合理设计此类杂合体。

2 四氮唑-唑杂合体

2.1 四氮唑-三氮唑杂合体

对一系列四氮唑-1,2,4-三氮唑杂合体1(图1)及其位置异构体2、光学异构体3和4的体外抗药敏型和耐药型白色念珠菌、热带假丝酵母、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假丝酵母和黑曲霉的活性测试结果表明，这类杂合体的最小抑制浓度(MIC)为0.12～＞16.0μg/mL，高于对照化合物伊曲康唑(MIC:0.007～0.5μg/mL)。SAR研究结果表明，光学活性中心对这类杂合体的抗真菌活性有显著影响，且含有2R,3S-手性碳的杂合体3(MIC:0.25～＞16.0μg/mL)和4(MIC:0.12～＞16.0μg/mL)比非光学活性的类似物1(MIC:1.0～＞16.0μg/mL)和2(MIC:0.5～＞16.0μg/mL)的活性更高。杂合体1和3的抗真菌活性与其位置异构体2和4相当，提示药效团的连接方式对活性影响不大。与相应的无取代衍生物相比，向R1位引入甲基可提高这类杂合体的抗真菌活性。向苯环引入氟、氯、硝基和三氟甲基等吸电子基或正丁氧基等供电子基可改善活性，而用吡啶或苄基代替苯基则不能明显提高活性。其中，代表物4d(MIC:0.12～1.0μg/mL)对所测10株真菌的抑制作用与伏立康唑(MIC:0.015～0.5μg/mL)和泊沙康唑(MIC:0.12～1.0μg/mL)相当，对热带假丝酵母、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假丝酵母、黑曲霉和耐药白色念珠菌的活性是氟康唑(MIC:2.0～8.0μg/mL)的16倍。将N4-芳基哌嗪基-N1-乙基去除所得的杂合体5(MIC:100μg/mL)和6(MIC:12.5～100μg/mL)对白色念珠菌仅显示出弱到中等强度的活性，说明此结构片段对提高体内外活性至关重要。体内外抗真菌SAR研究结果显示，苯环上的取代基与活性息息相关，其相对贡献顺序为2,4-二氟＞2-氟＞4-氯＞4-氟。其中，杂合体6a(MIC:12.5μg/mL)的活性最高，其抗白色念珠菌活性是对照药氟康唑(MIC:100μg/mL)的8倍。在白色念珠菌感染的CDF1小鼠模型中，杂合体6a的半数有效量(ED50)为0.18mg/kg，低于氟康唑(ED50:0.29～0.35mg/kg)。总之，良好的体内外活性使得杂合体6a可作为先导物深入研究。进一步研究表明，四氮唑-1,2,4-三氮唑-3-酮杂合体7(ED50:0.71～2.0mg/kg)的体内活性普遍弱于四氮唑-1,2,4-三氮唑杂合体6(ED50:0.18～1.54mg/kg)，提示羰基的引入对活性不利。四氮唑-1,2,4-三氮唑杂合体8(MIC:50和25μg/mL)对白色念珠菌具有中等活性，但弱于对照药克霉唑和咪康唑(MIC:6.25和3.12μg/mL)。

图1 四氮唑-三氮唑杂合体1～10的化学结构

1,2,4-三氮唑-3-酮结构片段N-1位含有烷基、环烷基、吡啶基亚甲基和苄基的四氮唑-4-吡啶基-1,2,4-三氮唑-3-酮杂合体9对白色念珠菌Y0109、白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假丝酵母、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌和烟曲霉具有潜在的活性，MIC为0.125～＞64μg/mL。SAR显示，含有大体积疏水性基团的杂合体对念珠菌属和新生假丝酵母的活性更高，优于氟康唑。杂合体9a～9c(MIC:0.125～4μg/mL)对除烟曲霉外的所有检测致病真菌均具有良好体外活性，与氟康唑(MIC:0.5～8μg/mL)相当或更优。此外，杂合体9a～9c对人CYP3A4无抑制作用，提示其发生药物相互作用的风险较低。Kamble等筛选了四氮唑-1,2,3-三氮唑杂合体10的体外抑血管紧张素转换酶、抗增殖、抗炎和抗真菌活性，发现所有杂合体(在浓度为25μg/mL时的抑菌圈为11～18mm)对黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉和白色念珠菌均有潜在的活性，但其活性低于对照药氟康唑(在浓度为20μg/mL时的抑菌圈为19～22mm)。

2.2 四氮唑-四氮唑杂合体

与相应的单核化合物相比，二聚体和三聚体化合物往往表现出一些独特的性质，如更高的生物活性，故有必要对四氮唑二聚体和三聚体的抗真菌活性进行研究。四氮唑二聚体11(图2)对所测黄曲霉、烟曲霉、马尔尼菲青霉菌和须毛癣菌显示出良好的活性，MIC为6.25～50μg/mL。SAR表明，N-1位取代基对活性有显著影响，其顺序为苄基＞环丙基≈乙基。代表物11c(MIC:6.25μg/mL)对所测真菌的活性最高，可与伊曲康唑(MIC:6.25μg/mL)相媲美。

含色酮和1,3,5-三嗪的四氮唑三聚体12对白色念珠菌、黑曲霉、烟曲霉和酿酒酵母具有潜在的活性，MIC为＜0.16～2.5μg/mL。SAR显示，与未取代的杂合体12a相比，向苯环上引入甲基、氯、溴、甲氧基和硝基等取代基并不能明显提高这类杂合体的抗真菌活性，但羧基对活性有利。其中，代表物12m(MIC:＜0.16～0.625μg/mL)对所测所有真菌具有良好的活性，不逊于对照药氟康唑(MIC:＜0.16～0.312μg/mL)。

2.3 四氮唑-苯并咪唑杂合体

图2 四氮唑二聚体11和三聚体12的化学结构

图3 四氮唑-苯并咪唑杂合体13～15的化学结构

苯并咪唑是药物分子中的常见药效团，其衍生物也具有潜在的抗真菌活性，故将其与四氮唑杂合也是研发新型抗真菌药物的潜在途径。研究发现，四氮唑-苯并咪唑杂合体13a(图3)和13b(MIC:25～50μg/mL)的抗白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的活性与酮康唑(MIC:25～50μg/mL)相当。四氮唑-苯并咪唑杂合体14对白色念珠菌、光滑念珠菌、克鲁氏假丝酵母和热带念珠菌的MIC为4～＞64μg/mL，SAR显示，向苯并咪唑结构单元引入芳环如4-氯苯基氧基(14a, MIC:16μg/mL)、咪唑(14b, MIC:8～16μg/mL)和1,2,4-三氮唑(14c, MIC:4～8μg/mL)等对活性有利，但所有杂合体的活性均弱于氟康唑(MIC:1～4μg/mL)。四氮唑-苯并咪唑杂合体15(MIC:125～＞1000μg/mL)对白色念珠菌和烟曲霉显示出弱到中等强度的活性，SAR研究结果表明，R2位的取代基与活性息息相关，且甲氧基优于氢、甲基和氯等。代表物15a(MIC:125μg/mL)的抗真菌活性与制霉菌素(MIC:100μg/mL)相当，对白色念珠菌的活性是灰黄霉素(MIC:500μg/mL)的4倍，值得进一步研究。

2.4 四氮唑-噻(二)唑/噁二唑杂合体

四氮唑-苯并噻唑杂合体16(浓度为250μg/mL时的抑菌圈为13～23mm)对白色念珠菌和黑曲霉显示出中等强度的活性，但弱于对照药氟康唑(浓度为100μg/mL时的抑菌圈为25和22mm)，见图4。SAR表明，向苯环引入供电子基或吸电子基均不能明显提高活性，提示该位点取代基对活性影响较小。

图4 四氮唑-噻(二)唑/噁二唑杂合体16～20的化学结构

对四氮唑-苯并噻唑和四氮唑-苯并噁唑杂合体17的体外抗白色念珠菌、黑曲霉、黑色炭疽病菌、接骨木镰孢和尖孢镰孢菌活性研究结果表明，四氮唑-苯并噁唑杂合体17e～17h(浓度为64μg/mL时的生长抑制率为4%～46.7%)对黑曲霉、黑色炭疽病菌、接骨木镰孢和尖孢镰孢菌的活性优于相应的苯并噻唑类似物17a～17d(浓度为64μg/mL时的生长抑制率为0%～36.7%)。杂合体17e～17h对白色念珠菌的抑制作用尽管弱于氟康唑(浓度为32μg/mL时生长抑制率为17.6%～100%)，但杂合体17b、17d、17g和17h(浓度为0.0313μg/mL时的生长抑制率为98.80%～99.36%)对白色念珠菌的活性极高。

四氮唑-噻唑啉杂合体18(MIC:125～250μg/mL)对寄生曲霉、产黄青霉、哈茨木霉菌、黄曲霉、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、大刀镰刀菌具有潜在的活性，对除产黄青霉外的其它所有所测微生物的活性均不低于酮康唑(MIC:125～500μg/mL)。SAR研究发现，R1和R2位的取代基几乎不会影响这类杂合体的抗真菌活性。

四氮唑-噻二唑杂合体19也显示出潜在的抗真菌活性，其在浓度为50μg/mL时对茄链格孢、灰霉菌、褐斑病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯晚疫病菌、苹果轮纹病菌、水稻纹枯病菌、核盘菌和禾谷丝核菌的生长抑制率为20.00%～65.38%。四氮唑-1,3,4-噁二唑杂合体20对革兰阳性菌、革兰阴性菌、结核分枝杆菌和真菌具有广谱抗菌活性，对白色念珠菌和黑曲霉的MIC分别为50和100μg/mL，略弱于对照药霉可唑(MIC:25和12.5μg/mL)。

2.5 四氮唑-吡唑/硒代咪唑杂合体

吡唑类化合物具有多种生物活性，且某些临床上使用的药物如塞来昔布、安替比林和苯丁氮酮等均含有吡唑结构片段。因此，有必要将吡唑与四氮唑杂合。

四氮唑-苯并吡唑杂合体21(图5)在浓度为500μg/mL时对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌圈为11～20mm，但弱于酮康唑(浓度为50μg/mL时的抑菌圈为23mm和26mm)。与未取代的类似物相比，氯、硝基和三氟甲基等吸电子基的引入对抗真菌活性有利，而供电子的甲基和甲氧基则会导致活性的降低。

绝大多数四氮唑-1,2,3-硒二唑杂合体22对白色念珠菌和黑曲霉的活性较弱，MIC为100～400μg/mL，但活性最高的杂合体22b和22c(MIC:6.25μg/mL)对白色念珠菌的活性与氟康唑(MIC:6.25μg/mL)相当。

3 四氮唑-喹啉/喹诺酮杂合体

喹啉和喹诺酮类化合物不仅在抗疟疾和抗菌领域发挥着重要作用，这类化合物也具有潜在的抗真菌活性。因此，将喹啉/喹诺酮药效团与四氮唑杂合是开发新型抗真菌药物的有效途径。

图5 四氮唑-苯并吡唑21和四氮唑-硒代咪唑杂合体22的化学结构

图6 四氮唑-喹啉/喹诺酮杂合体23～36的化学结构

含有罗丹明结构片段的四氮唑-喹啉杂合体23(图6)和24(MIC:25～150μg/mL)对白色念珠菌、黑曲霉、黄曲酶、新型隐球菌和尖孢镰孢菌具有潜在的活性，但弱于咪康唑(MIC:12.5～25μg/mL)。SAR表明，与无取代基的杂合体23相比，含有羧基的杂合体24对白色念珠菌、黄曲酶和尖孢镰孢菌的抑制活性较高。连接子的长度对抗真菌活性也有一定影响，且短连接子(n=1)比长连接子(n=2)对活性有利。其中，代表物24b(MIC:25～50μg/mL)对白色念珠菌、黄曲酶、新型隐球菌和尖孢镰孢菌的抗真菌活性与咪康唑相当。进一步研究发现，磷酸乙酯(25, MIC:10～25μg/mL)、查尔酮(26, MIC:25～175μg/mL)、吡唑啉(27, MIC:25～100μg/mL)和噁唑啉(28和29, MIC:25～100μg/mL)可替代罗丹明片段，且这些药效团对活性的贡献顺序为磷酸乙酯＞噁唑啉≈吡唑啉≈罗丹明＞查尔酮。值得一提的是，活性最高的杂合体25g和29e(MIC:10和25μg/mL)对白色念珠菌和黄曲酶的活性与灰黄霉素(MIC:10μg/mL)和氟康唑(MIC:25μg/mL)相当，极具进一步开发前景。

四氮唑-喹啉杂合体30～32具有良好的体内抗炎和体外抗菌活性，但抗白色念珠菌活性(MIC:≥100μg/mL)远低于克霉唑(MIC:12.5μg/mL)。含有苯并咪唑结构单元的四氮唑-喹啉杂合体33对白色念珠菌也显示出潜在的活性(浓度为125μg/mL时的抑制圈为7～12mm)，其活性略低于氟康唑(抑制圈:14mm)。

大多数四氮唑-喹啉杂合体34(MIC:2.5～50μg/mL)及其位置异构体35(MIC:2.5～50μg/mL)的抗白色念珠菌和烟曲霉活性优于对照品氟康唑(MIC:30μg/mL)，但杂合体34与其位置异构体35之间没有显著差异，提示连接模式对这类杂合体的抗真菌活性影响较小。杂合体34b、34d、34f、34h、35d, 35f和35h(MIC:10μg/mL)对白色念珠菌的活性是氟康唑的3倍，而杂合体34j和35j(MIC:2.5μg/mL)对烟曲霉的活性则是氟康唑的12倍。

四氮唑-萘啶酮杂合体36(MIC:6.25～100μg/mL)对白色念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、印度毛霉和少根根霉具有显著的抑制活性，且苯环上含吸电子的氟(36d，MIC:6.25μg/mL)和硝基(36g，MIC:6.25μg/mL)时能改善对黑曲霉的抑制活性。

4 四氮唑-吡啶杂合体

四氮唑-吡啶杂合体VT-1161(37a，图7)是一种对隐球菌具有优秀体内外活性的真菌特异性cyp51抑制剂，目前正处于抗真菌III期临床试验阶段。VT-1161具备成为复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)患者最佳治疗选择的药物潜力，并有望成为FDA批准的治疗该常见疾病的首款药物。VT-1161的衍生物VT-1129(37b)是一种潜在的口服抗隐球菌感染药物，本品在隐球菌性脑膜炎小鼠模型中显示出良好的体内疗效(与氟康唑相比小鼠的存活期延长了30d)，被FDA视为治疗隐球菌性脑膜炎的潜在药物。目前，VT-1129正在美国进行I期临床试验，从已报道的结果可知，该杂合体具有优秀的抗真菌活性。

四氮唑-吡啶杂合体38(浓度为50μg/mL的抑制圈为10～19mm)对白色念珠菌和烟曲霉的活性均低于酮康唑(浓度为10μg/mL的抑制圈为23和24mm)。研究发现，与未取代的杂合体相比，向苯环上引入卤素原子氯或溴可提高抗真菌活性。卤素原子的个数也在一定程度上影响抗真菌活性，双氯杂合体38j(浓度为50μg/mL的抑制圈为16和18mm)的抗真菌活性高于相应的单氯化合物38c(浓度为50μg/mL的抑制圈为15和17mm)。代表物38b(浓度为50μg/mL的抑制圈为17和19mm)对白色念珠菌和烟曲霉的活性最高，可作为先导物进一步研究。

5 四氮唑-嘧啶杂合体

图7 四氮唑-吡啶杂合体37和38的化学结构

图8 四氮唑-嘧啶杂合体39～44的化学结构

嘧啶是细胞的基本代谢产物，且嘧啶基团也是许多药物的药效团。因此，四氮唑-嘧啶杂合体可能是潜在的抗真菌候选物。四氮唑-嘧啶杂合体39(图8)(MIC:＜0.16～5μg/mL)对白色念珠菌、烟曲霉、黑曲霉和酿酒酵母具有良好的抑制作用，SAR显示向苯环无论引入供电子基还是吸电子基均可提高这类杂合体的抗真菌活性。含有氢键供体--羟基的杂合体39i(MIC:＜0.16～0.625μg/mL)对烟曲霉、黑曲霉和酿酒酵母的活性是氟康唑(MIC:0.625～2.5μg/mL)的2倍以上，提示氢键供体可能对这类杂合体的抗真菌活性有利。

抗菌和抗真菌评价结果表明，四唑并[1,5-a]嘧啶杂合体40d(MIC:7.81～62.5μg/mL)和40e(MIC:3.91～62.5μg/mL)对所测所有微生物具有显著活性，但其余杂合体则未显示出任何活性。值得一提的是，杂合体40e(MIC:3.91～7.81μg/mL)对革兰阳性和革兰阴性细菌(包括耐药菌株)均具有较高的活性，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的活性是甲氧西林(MIC:250μg/mL)的64倍以上。杂合体40e(MIC:62.5μg/mL)对白色念珠菌具有中等水平的抑制活性，但远弱于对照药两性霉素B(MIC:0.48μg/mL)。杂合体41和42(在浓度为100μg/mL时的抑菌圈为6～22mm)对白色念珠菌也显示出潜在的抑制作用，其中活性最高的化合物41d(在浓度为100μg/mL时的抑菌圈22mm)略优于制霉菌素(在浓度为100μg/mL时的抑菌圈21mm)。四氮唑-嘧啶酮杂合体43(在浓度为1mg/mL时的抑菌圈1.8～2.5mm)对黄曲霉、烟曲霉和黑曲霉的抑制活性与制霉菌素(在浓度为1mg/mL时的抑菌圈2.4～2.8mm)相当。化合物44(MIC:50～400μg/mL)对白色念珠菌和黑曲霉显示出弱到中度的活性，且活性远低于氟康唑(MIC:6.25μg/mL)。

6 其它四氮唑杂合体

四氮唑-查尔酮杂合体45(图9)对白色念珠菌、烟曲霉、黑曲霉和灰色孢囊放线菌具有较高的活性(MIC:＜0.16～10μg/mL)，但对红笼头菌(MIC:10～＞80μg/mL)仅显示出弱到中等强度的活性。SAR表明，用吡啶基取代苯环将会导致活性的急剧降低。与杂合体39相似，氢键供体-羟基的引入可提高其抗真菌活性。代表物45i(MIC:＜0.16～1.25μg/mL)对白色念珠菌和灰色孢囊放线菌的活性与氟康唑(MIC:＜0.16和1.25μg/mL)相当，对烟曲霉和黑曲霉的活性是氟康唑(MIC:0.625和2.5μg/mL)的4倍。四氮唑-黄酮杂合体46(MIC:12.5～50μg/mL)对白色念珠菌、平滑念珠菌和热带念珠菌具有潜在的活性，其对平滑念珠菌和热带念珠菌的活性是咪康唑(MIC:400和800μg/mL)的8～64倍。SAR显示，与无取代化合物46a相比，向C-6或C-8位引入氯基和甲基不会显著增强活性，但第二个氯的引入会导致活性降低。杂合体46a，46b和46f(MIC:12.5～25μg/mL)对白色念珠菌的活性与咪康唑(MIC:12.5μg/mL)相当，对平滑念珠菌和热带念珠菌的活性是咪康唑的16～64倍。因此，这三个杂合体都具有进一步研究价值。

图9 四氮唑杂合体45～47的化学结构

除上述杂合体外，四氮唑-雌酮、四氮唑-腙、四氮唑-吡咯、四氮唑-β-内酰胺、四氮唑-内酯、四氮唑-哒嗪、四氮唑-香豆素和四氮唑-安布罗替星杂合体也显示出某种程度的抗真菌活性，其中某些杂合体如47(对黄曲霉和烟曲霉的MIC为1.5μg/mL)的活性极高，但绝大多数此类杂合体的活性远低于目前使用的抗真菌药物，仍需进一步优化。

7 结论

侵袭性真菌感染是严重威胁人类生命健康的致死性传染病，每年全球每年超过百万人因此丧命，给世界各国医疗卫生系统带来了沉重的负担。目前，临床上使用的抗真菌药物普遍存在着疗效不理想和毒副作用大等诸多缺点，而耐药真菌的出现和广泛传播使真菌感染的治疗变得更加复杂。因此，开发新型抗真菌药物迫在眉睫。

四氮唑具有广谱生物活性，在新药开发中发挥着重要作用。四氮唑具有潜在的抗真菌活性，故将四氮唑与其它具有抗真菌活性的药效团杂合具有提高活性、降低毒副作用和克服耐药性的潜力。在过去的三十年中，科学家经过不懈的努力已经筛选出多种具有优秀体内外抗真菌包括耐药真菌活性的四氮唑类化合物。其中，VT-1161和VT-1129是该领域的杰出代表。目前，二者正处于治疗真菌感染的临床试验中，有望于不久的将来为人类健康服务。

本文综述了近年来四氮唑杂合体在抗真菌领域的最新研究进展，并归纳了其构-效关系，丰富的构-效关系可为进一步合理设计活性高、毒性低、作用机制多样的四氮唑杂合体奠定基础。