光动力疗法在抑制细菌外排耐药系统的作用

黄娇 编译，穆青 审校

(复旦大学药学院，上海 201203)

光动力疗法(PhotodynamicTherapy, PDT)是一种利用光动力反应进行疾病诊断与治疗的新兴学科分支，光、光敏剂以及组织中氧分子为光动力疗法的三要素。早期研究发现，光敏剂联合光照可杀灭细胞，此过程具有氧依赖性，由此提出了光动力效应(photodynamic effect)的概念。近年，有研究表明，光动力疗法除了在治疗肿瘤方面疗效显著外，还可与外排泵抑制剂联用以控制多药耐药致病菌引起的感染。文章根据国外文献综述对光动力疗法进行了系统介绍，并且概述了光动力疗法对于抑制细菌外排系统潜在应用价值与发展前景。

1 光动力疗法的简介

鉴于多种药物外排泵增强了各种抗生素和抗菌药物的抗药性，因此需要发现非传统的抗菌药物。光动力疗法(PDT)是一种以光为基础的技术平台，采用无害可见光与无毒感光剂(PS)联合的手段以控制感染(图1)。Christina Kourtesi等在期刊The Open Microbiology Journal, 2013, 7(Suppl 1-M3):34-52发表了题目为Microbial Efflux Systems and Inhibitors:Approaches to drug discoveryand the challenge of clinical implementation的综述文章，我们通过编译其后半部分内容介绍抗细菌耐药的光动力疗法以及协同作用物质。

以往，PDT在癌症治疗中起着重要作用，目前也被用于治疗年龄相关性黄斑病变。目前正在研究以光动力疗法作为局部感染的替代疗法，光敏剂通常是具有高度电子离域的有机芳香族分子。目前已经提出了卟啉、二氢卟酚、细菌二氢卟酚，酞菁以及多种具有不同分子结构的染料作为抗菌光敏剂的说法，这些染料包括卤化呫吨，如玫瑰红(RB)，苝醌 (例如金丝桃素)，吩噻嗪鎓染料如亚甲基蓝(MB)和甲苯胺蓝(TBO)阳离子富勒烯，例如C60衍生物和呋喃香豆素类化合物补骨脂素。

光动力疗法与传统的药物发现平台相比有很大不同，因为三个要素：光敏剂，可见光和氧气，对于成功开发药物至关重要。合理设计有效光敏剂的主要挑战之一是，光活性剂的电子激发态，单线态，三重态和反应性中间体可引起细胞毒性，这促使借助复杂的高水平计算机的量子化学方法来处理激发状态。这种电子计算机模拟结合光物理实验研究需要合理调整光敏剂的期望性质，包括暗毒性、摩尔吸光系数、吸收波长，单-三重态系统交叉量子，以及后来单线态氧的产生，也可能研究开放式剪切物质(sheel species)—在没有氧气的情况以防产生光毒性的自由基阳离子。通过化学修饰可增强已知的染料，以及重新考虑能够吸收期望的波长窗口 (600～850nm) 外波长的染料，如黄-橙色染料，这种染料由有效的红色激光产生，并且具有双光子吸收特性。另外，通过制备高度带正电的衍生物或光敏剂和抗体的缀合物或纳米颗粒，可改善其特异性和/或细胞积累。

2 多药外排系统在光动力疗法中的作用

细菌表型的许多因素可能在光动力疗法的应用中发挥重要作用。必须使用复杂的工具和方法来应对这一系列技术挑战，这些工具和方法能解决有关耐药机制，生物膜灭活和持续细胞形成的复杂生物学问题。有关生物膜光灭活或用于微生物感染模型的光动力疗法的实例并没有经过验证。尽管有一个显著的例外：有一份宿主寄生虫模型的报告，可评估新型酞菁针对感染巨噬细胞和树突状细胞的利什曼原虫寄生虫的细胞内靶向特异性。但是，宿主病原体研究提供的信息很少，而这项研究可探索光动力疗法干扰毒力决定簇的能力，然而，非特异性作用机制和成功的临床实践促进并引导不断增长的有关光动力疗法的研究的大量关键案例，见图1。

由光敏剂介导的光动力疗法已经在外排系统中发现，包括哺乳动物ABC转运蛋白ABCG2(或乳腺癌抗性蛋白BCRP)，ABCC1(或多药耐药相关蛋白1，MRP1)以及少量的扩展到ABCB1(P-糖蛋白，P-GP)。主要证据来自于卟啉(植物卟啉，原卟啉IX)、焦偏相藻和紫嘌呤酰胺的多种光动力疗法研究。ABG2和ABCC1都影响HT-29腺癌细胞中金丝桃素介导的光动力疗法的结果。很明显，在这两个系统中，多药外排系统影响各种化学型光敏剂的光动力疗法。对于ABCB1，氯e6和补骨脂素是否可作为光敏剂的底物，其证据是零散和矛盾的。仅在一种情况下，金丝桃素-米托蒽醌鸡尾酒加蓝光照明，对过度表达P-糖蛋白(P-gp)的膀胱癌和乳腺癌细胞可增强细胞毒性。

两种吩噻嗪染料亚甲基蓝和甲苯胺蓝是两亲性阳离子，在物理化学上类似于天然抗菌生物碱小檗碱，是革兰阳性菌中MFS外排系统的底物，这提高了吩噻嗪光敏剂作为微生物外排系统底物的可能性。实验表明吩噻嗪是金葡菌中NorA(MFS)的底物，可能也是铜绿假单胞菌中MexAB(RND)的底物。但是六十个过表达外排泵的铜绿假单胞菌临床分离株的模型研究，发现耐药铜绿假单胞菌作为易感菌株对甲苯胺蓝介导的光动力疗法敏感，可见这种模型研究并不支持上述实验结论。ABC转运蛋白而不是MFS转运蛋白影响致病酵母白色念珠菌中亚甲基蓝介导的光动力疗法，这一过程是复杂的。使用亚甲基蓝和ABCB1晶体结构的电脑模拟增加了这一复杂性。该研究表明，由于形状和电子分布相似，光敏剂结合位点与经典外排底物小檗碱和罗丹明6G重叠(图2)，由此可知，亚甲蓝似乎至少与小檗碱和罗丹明一样是ABCB1的底物。外排系统可能解释卟啉可作为潜在的底物，卟啉吸收和外排过程似乎是由大肠埃希菌中的TolC系统调控。

图1 光动力灭活机制示意图。

图2 外排底物与光敏剂作用示意图

3 结语

光动力疗法和其他替代疗法为外排泵抑制剂发挥作用奠定了基础。另外，需要进一步阐明：外排系统已经进化，以排出广泛的非特异性化合物，包括不会攻击单一靶标的潜在毒素。抗菌光敏剂，如两亲性阳离子，为微生物外排系统的宿敌，并且天然外排泵抑制剂与光动力灭活剂联用具有更加广泛的应用前景。天然外排泵抑制剂在增强大部分无效抗菌药物(如小檗碱)的抗菌效果方面有显著的疗效，光动力疗法能够表现出比天然抗菌剂更高的杀灭功效，因此可以将基于光敏剂的光动力疗法与传统抗生素相结合。体外和临床前研究之间仍然存在明显的方法学差距。随着微生物外排系统的进化，有效设计外排泵抑制剂以及将光动力疗法与外排泵抑制剂相结合的抗菌策略仍然是目前面临的一大难题。