响应面法优化当归多糖超声提取工艺研究

李海燕，范明辉，时薛丽，范景辉，*

（1.牡丹江医学院附属红旗医院药学部，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院心脏重症医学科，黑龙江 牡丹江 157011）

当归为伞形科植物当归Aaugellica sinensis（Oliv.）Diels.干燥根，甘、辛，温。具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效[1-3]。其主要成分为阿魏酸、挥发油和多糖。当归多糖是当归的有效成分之一，是当归活血、补血的中药物质基础，研究表明，当归多糖具有多种免疫活性，具有抗肿瘤和调节免疫功能以及镇痛等作用[4-8]。Box-Behnken 是采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，寻求最佳的工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[9-14]。有关当归多糖提取的报道较多，但利用响应面法优选当归多糖超声提取工艺的文献还未见报道，本文采用超声波提取法提取当归多糖，结合响应面法对数据进行分析，优选最佳的提取工艺，为下一步研究提供研究基础。

1 仪器与材料

紫外可见分光光度计（Cary100）：美国VARIAN（瓦里安）公司；超声波提取器（HN-1000CT）：上海汉诺仪器有限公司；中药材粉碎机（FW177 型）：天津市泰斯特仪器有限公司；数控超级恒温水浴（SC-15 型）：宁波海曙天恒仪器厂；电热鼓风干燥箱（101-0 型）：上海科辰实验设备有限公司；电子天平（BSA224S）：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

当归药材：产地甘肃，批号160307，经鉴定为伞形科植物当归 Aaugellica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根；水为重蒸水；葡萄糖、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 当归多糖的含量测定

2.1.1 当归多糖的超声提取

样品烘干→粉碎过筛→脱脂→超声提取→抽滤→浓缩→脱色→醇沉→离心分离→沉淀物用丙酮、乙醚清洗→干燥→得多糖。

2.1.2 标准曲线的建立

精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，蒸馏水定容至100 mL 的容量瓶中，得到浓度为0.5 mg/mL的葡萄糖对照品。精密量取葡萄糖对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于 50 mL 的容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀。各精密吸取2.0 mL 置干净的试管中，各管加入5%的苯酚1 mL，混匀，迅速加入浓硫酸6 mL，摇匀，静置10 min 后，放入90 ℃水浴中加热20 min，取出冷却至室温，在490 nm 处测定吸光度，以浓度（c：μg/mL）为横坐标，以吸光度 A 为纵坐标，绘制得到标准曲线。y=0.005 8x+0.022 7，r2=0.999 2。线性关系良好。

2.1.3 当归多糖的含量测定

精密称取提取的当归多糖100 mg，置于小烧杯中，溶解，定容至100 mL 的容量瓶中，浓度为1 mg/mL，精密称取1 mg/mL 的当归多糖溶液5 mL，用蒸馏水定容于50 mL 的容量瓶中，使成浓度为0.1 mg/mL。吸取2 mL 置于干净的试管中，各管加入5%的苯酚1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸6 mL，摇匀，放入90 ℃水浴中加热20 min，取出冷却至室温，在490 nm 处测定吸光度。计算当归多糖的提取率。

2.1.4 当归多糖提取率的计算

2.2 单因素试验

2.2.1 液料比

称取脱脂处理后的当归粉末5 g，加入液料比为10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的水，选择功率400 W，超声温度50 ℃，超声提取1 h，处理后测定多糖含量。液料比对当归多糖提取率的影响见图1。

图1 液料比对多糖提取率的影响Fig.1 Effects of different solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

结果表明随着液料比的增加，多糖的提取率上升，当液料比为 20 ∶1（mL/g）时，多糖的提取率最高，当液料比超过 20 ∶1（mL/g）时，多糖的提取率减小，但变化的不明显。因此选择液料比 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）进行响应面优化试验。

2.2.2 功率

称取脱脂处理后的当归粉末5 g，选择液料比为20 ∶1（mL/g），功率为 300、400、500、600、700 W，超声温度50 ℃，超声提取50 min，处理后测定多糖含量，见图2。

图2 功率对多糖提取率的影响Fig.2 Effects of different ultrasonic power on polysaccharide extraction rate

结果表明随着功率的增加，多糖提取率上升，当功率超过500 W 时，多糖提取率基本不变，当功率超过500 W 时，功率的增加对多糖提取率的影响较小。因此，在响应面优化试验中固定功率为500 W。

2.2.3 提取时间

称取脱脂处理后的当归粉末5 g，选择液料比为20 ∶1（mL/g），功率为 500 W，超声温度 50 ℃，超声提取30、40、50、60、70、80 min，处理后测定多糖提取率，见图3。

图3 提取时间对多糖提取率的影响Fig.3 Effects of different time on polysaccharide extraction rate

结果表明随着超声时间的增加，多糖提取率上升当超声时间为60 min 时，多糖含量最高，然后随超声时间增加提取率下降。因此选择超声时间50、60、70 min进行响应面优化试验。

2.2.4 超声温度

选择液料比为 20 ∶1（mL/g），功率为 500 W，超声时间 60 min 考察不同超声温度 25、35、45、55、65 ℃对多糖提取率的影响，见图4。

图4 超声温度对多糖提取率的影响Fig.4 Effects of different temperature on polysaccharide extraction rate

结果表明随着超声温度的增加，多糖提取率上升。当超声温度为35 ℃时，多糖提取率最高，然后随超声温度增加提取率下降，可能是温度过高破坏了多糖的结构。因此选择超声温度25、35、45 ℃进行响应面优化试验。

2.3 响应面分析

在单因素试验的基础上，由于功率超过500 W时，多糖提取率基本不变，因此固定功率为500 W。利用Box-Benhnken 的设计原理，选取超声温度（A）、液料比（B）、超声时间（C）3 个因素，选取 3 个水平以-1、0、1 为编码，设计三因素三水平的响应面分析对当归多糖提取率进行优化。共设计17 个试验点，其中1号～12 号是析因设点，13 号～17 号是零点，试验因素及编码见表1，响应面分析试验设计及结果见表2。

表1 因素及水平Table 1 Factors and levels

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

续表2 响应面分析试验设计及结果Continue table 2 Response surface experimental design and results

通过回归分析，得到当归多糖提取率（Y）与超声温度（A）、液料比（B）、超声时间（C）的二次多项回归模型：Y=-17.60+0.201 5A+0.962 4B+0.417 0C-0.004 483A2-0.021 93B2-0.003 632C2+0.000 550AB+0.001 925AC-0.001 850BC。归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

从表3 可知，模型的P＜0.01，表明回归模型极显著；失拟项P＞0.05，失拟项不显著；相关系数R2=0.992 7，说明模型拟合程度较好。该模型能够解释98.32%的响应值变化。因此，可以利用此模型来分析和预测当归多糖的提取工艺条件。应用minitab 软件，得到响应面的分析图见图5～图7。

图5 超声温度和液料比对多糖提取率的影响Fig.5 Effect of temperature and solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

图6 超声温度和超声时间对多糖提取率的影响Fig.6 Effect of temperature and time on polysaccharide extraction rate

图7 液料比和超声时间对多糖提取率的影响Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and time on polysaccharide extraction rate

对参数进行优化，得到最佳的工艺条件为：超声温度：37.12 ℃、液料：19.75 ∶1（mL/g）、超声时间62.12 min。该条件下当归多糖的提取率为8.621 71%。

2.4 验证试验

为了验证响应面试验的可行性，利用响应面试验得到的最佳工艺条件进行试验，考虑到实际操作的便利性选择超声温度 37 ℃、液料比 20 ∶1（mL/g）、超声时间62 min。精密称取当归粉末5 g，在最后确定的工艺条件下提取当归多糖，平行测定3 次，得到多糖得率平均值为8.63%，与预测值接近，表明该模型可靠，可用于当归多糖的超声提取。

3 结论

本次试验通过超声辅助提取了当归中的多糖，通过响应面试验分析，找到了超声提取当归多糖的最佳控制点，通过响应面试验得到最佳的提取条件为：37 ℃、液料比 20 ∶1（mL/g）、提取时间 62 min，提取率为8.63%，与模型的估计值相近，说明用响应面法优化得到的模型准确、可靠。与正交试验相比，响应面法更能准确地确定最佳的工艺条件。因此，采用响应面法优化得到的提取条件准确可靠、提取率高，具有实用价值。