超高效液相色谱-串联质谱法测定稻田水产品中毒死蜱残留

彭 婕, 甘金华,2, 居小倩, 陈建武, 何 力,2*(.中国水产科学研究院长江水产研究所,农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心,农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉),湖北 武汉 430223;2.农业农村部水产品质量安全控制实验室,北京 004)

稻渔共作是近几年兴起的绿色、环境友好型水产品养殖模式,可实现种养共生互利,促进农民丰产增收,因此在中国得到广泛应用。与此同时,种稻过程中所用农药对稻田养殖水产品食用安全性的影响也受到一定程度的关注。毒死蜱作为一种高效的杀虫剂在我国南方水稻种植区域广泛使用。有报道[1,2]指出,毒死蜱对水生生物具有较高的毒性,毒死蜱中毒后可引起呼吸系统、心血管和肠道方面的疾病。最新研究显示,暴露于毒死蜱的环境中可引起甲状腺疾病、帕金森病等[3,4]。稻田水产品作为稻田环境中主要的生物类群,极易因富集效应受到养殖环境中毒死蜱的影响,但关于稻田水产品农药残留相关质量安全问题却鲜有研究。

毒死蜱的检测方法主要包括气相色谱法(GC)[5,6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8,9]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[10]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[11-13]。液相色谱-串联质谱法与气相色谱法和高效液相色谱法相比,具有抗干扰能力强、灵敏度高、选择性强等优点;同时它比气相色谱-质谱法和气相色谱-串联质谱法具有更好的稳定性和准确度。目前仅有采用气相色谱和气相色谱-串联质谱测定水产品中毒死蜱方法的报道,利用液相色谱-串联质谱测定水产品中毒死蜱的检测方法未见报道。

本文采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对稻田养殖水产品(主要为鲤鱼和克氏原螯虾)中毒死蜱进行定性定量分析。该方法简便、快捷、灵敏度高,为稻田水产品中农药残留监控和质量安全评价提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪、TSQ Quantiva三重四极杆-质谱仪附加热大气压电喷雾电离源和Trace Finder 3.2数据处理系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

毒死蜱标准品(纯度99.8%,德国Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇(色谱纯,德国Merck公司);乙腈、乙酸乙酯、甲酸和乙酸(色谱纯,美国J.T.Baker公司);乙酸铵(色谱纯,美国Fisher公司);无水硫酸镁(MgSO4)(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA,40～60目)、石墨化炭黑(GCB,120～400目)(德国CNW公司);C18(40～60目,博纳艾杰尔科技有限公司);实验用水为Milli-Q高纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取毒死蜱标准品10 mg(精确至0.1 mg),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度线,配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液,于-20 ℃冰箱中保存;用初始流动相溶液将其稀释成相应的标准工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1样品制备

鲤鱼去鳞,带皮沿背脊取肌肉部分;克氏原螯虾去头、壳、肠腺,取肌肉部分。试样切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后均质、混匀,密封,标记,于-20 ℃冷冻保存,备用。

1.3.2提取

称取(2.00±0.01)g解冻后的样品,置于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋混匀1 min,于室温下超声提取5 min,以7 000 r/min冷冻离心5 min,取上清液,置于25 mL比色管中,重复提取一次,合并上清液并定容至刻度线,混匀,备用。

1.3.3净化

取10 mL上清液,置于15 mL具塞离心管中,依次加入0.2 g PSA和1.2 g MgSO4,涡旋振荡1 min,以7 000 r/min冷冻离心5 min,取5 mL上清液,置于30 ℃氮吹仪吹至小于1 mL,再用乙腈定容至1 mL,涡旋、混匀,过0.22 μm尼龙滤膜,供UPLC-MS/MS检测。

1.4 分析条件

色谱柱:Thermo Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm,5 μm);柱温:40 ℃;流动相:A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),B为甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:0～1.0 min,80%A;1.0～5.0 min,80%A～10%A;5.0～9.0 min,10%A;9.0～9.1 min,10%A～80%A;9.1～12.0 min,80%A。进样量:10 μL。

离子源:加热大气压电喷雾电离源,正离子模式;扫描方式:选择反应监测(SRM)模式;喷雾电压:3 500 V;蒸发温度:350 ℃;离子传输毛细管温度:330 ℃;鞘气(高纯氮气)流速:30 L/min;辅助气(高纯氮气)流速:5 L/min;监测离子对:m/z350.0/198.0(定量离子)和350.0/97.0;碰撞压力:20 V和30 V。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

查阅文献[14,15]发现,有机磷农药残留测定时流动相中水相多为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),有机相则常用甲醇或乙腈。本实验对比研究了有机相分别为甲醇和乙腈时,目标物的响应值和分离效果。结果表明，采用乙腈时,毒死蜱响应偏低,且色谱峰峰形较差;采用甲醇时,毒死蜱响应值升高很多,色谱峰峰形得到明显改善。

同时分别比较了柱温为30 ℃和40 ℃、流速为0.2 mL/min和0.3 mL/min条件下毒死蜱的分离效果。当色谱柱温度为30 ℃时,毒死蜱在梯度条件重回起始比例时才出峰,出峰时间较晚且色谱峰较宽,而40 ℃的柱温能够让毒死蜱出峰时间提前;对比流速为0.2 mL/min时毒死蜱的分离效果,当流速提高至0.3 mL/min时,毒死蜱在高有机相时出峰,保留时间提前,且色谱峰较窄,峰形对称。毒死蜱极性较弱,当柱温和流速更高时,更容易被洗脱出来,同时使用甲醇这种质子性溶剂,有助于提高其响应值。因此选择甲醇作为有机相,柱温选择40 ℃，流速选择0.3 mL/min。

图1 毒死蜱子离子的质谱图Fig.1 Mass spectrum of product ions of chlorpyrifos

2.2 质谱条件优化

质谱条件的优化主要包括优化化合物的母离子、子离子和碰撞能量等。取质量浓度为1 mg/L的毒死蜱标准溶液,用蠕动泵将其随流动相一同注入质谱仪中,在正离子模式下仪器自动对目标物进行质谱条件优化。实验发现,化合物优化时在水相中加入部分甲酸和乙酸铵,毒死蜱响应值较高,灵敏度较好。优化后毒死蜱子离子的质谱图见图1,毒死蜱脱水后子离子的m/z为322.0，但不适合被选作定性或定量离子，其他响应最强的两个子离子的m/z为97.0和198.0。因此选择响应强度最高的为定量子离子(m/z198.0),次高的为定性子离子(m/z97.0)。

2.3 前处理条件优化

2.3.1提取溶剂的选择

有机磷类药物多采用乙腈[5]、乙酸乙酯[8]、酸化乙腈[16]和酸化乙酸乙酯[17]作为提取溶剂。本实验比较了乙腈、乙酸乙酯、含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和含1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液作为提取剂时,鲤鱼和克氏原螯虾中毒死蜱的提取效率(见图2)。结果表明,当含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和含1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液作为提取剂时,目标物回收率偏低;采用乙酸乙酯提取目标物时,回收率可达70%以上,但回收率不稳定,平行样之间偏差较大,同时乙酸乙酯能够溶解水产品中大量脂肪,给后续净化增加困难;采用乙腈作为提取溶剂时,得到的色谱图峰形较好,且毒死蜱回收率高,能够满足分析要求。因此最终选择乙腈作为提取溶剂。

图2 采用不同提取溶剂时鲤鱼和克氏原螯虾中毒死蜱的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by the different extraction solvents (n=3)

2.3.2吸附剂种类和用量的选择

水产品中含有大量脂肪、蛋白质等杂质,如何去除成为净化的关键步骤。QuEChERS方法能够快速高效地去除水产品中的各类杂质,常用的吸附剂种类有PSA、C18、GCB和MgSO4。PSA通过氢键和化合物作用,可除去水产品中的脂肪酸和色素等物质。C18吸附剂常被作为QuEChERS方法的净化剂,它对非极性物质有较高的容量,因此对水产品中油脂的去除效果显著。C18和PSA混合使用能够有效去除强极性至弱极性的基质干扰物[18]。GCB则对色素有明显吸附作用。由于乙腈与水互溶,净化时加入MgSO4能够吸附提取剂中的水分,保证浓缩时的回收率。

实验比较了PSA(0.2 g)、C18(0～0.2 g)、GCB(0～0.2 g)和MgSO4(0.6～1.2 g)不同用量不同组合时对目标化合物回收率的影响(见表1)。对毒死蜱加标量为10 μg/kg的鲤鱼和克氏原螯虾进行分析,当净化试剂中加入C18或GCB时,毒死蜱回收率相对较低。当PSA采用0.2 g时，对比MgSO4分别选用0.6、0.9和1.2 g时毒死蜱的加标回收率,结果表明，采用1.2 g MgSO4时,毒死蜱的回收率最高,故选为所用。

表1 采用不同吸附剂时鲤鱼和克氏原螯虾中毒死蜱的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by the different absorbents (n=3)

PSA:primary secondary amine;GCB:graphitized carbon black.

2.3.3氮吹温度的选择

前处理中不同氮吹温度会对毒死蜱的回收率产生不同影响,因此选择适宜的氮吹温度也很重要。实验表明,当氮吹温度高于35 ℃时,毒死蜱的回收率较低;当温度低于25 ℃时,蒸发速度过慢,延长了前处理时间;当温度为30 ℃时,既获得了良好的加标回收率,又缩短了氮吹时间(见图3)。因此本实验选择30 ℃为最佳氮吹温度。

图3 采用不同氮吹温度时鲤鱼和克氏原螯虾中毒死蜱的回收率(n=3)Fig.3 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by different nitrogen blowing temperatures (n=3)

2.3.4溶解液的选择

实验比较了乙腈、5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(8∶2,v/v)、5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(2∶8,v/v)3种溶解液对目标物的溶解效率。结果显示,当溶解液为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(8∶2,v/v)时,毒死蜱的溶解效率<5%,绝大多数毒死蜱在此步骤损失;另外两种溶解液溶解残渣后,毒死蜱色谱峰峰形均很好,但因毒死蜱极性较弱,溶解液中水相比例越大,对目标化合物的溶解效率越低,因此选用乙腈作为溶解液。

2.4 方法评价

2.4.1线性范围、检出限及定量限

按1.3节方法分别对空白鲤鱼和克氏原螯虾样品进行前处理,得到鲤鱼和克氏原螯虾空白样品提取液,用提取液配制毒死蜱系列(0.5、2、5、10、20、50和100 μg/L)基质标准工作液,在最优的色谱和质谱条件下进行测定,采用外标法定量,以毒死蜱的质量浓度(X,μg/L)为横坐标、定量离子的峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。毒死蜱在0.5～100 μg/L范围内呈现良好的线性关系,鲤鱼基质匹配标准曲线方程为Y=88 729X+137 896,相关系数(R2)为0.999 1,克氏原螯虾基质匹配标准曲线方程为Y=94 115X-1 512.2,R2为0.999 9。

在空白鲤鱼和克氏原螯虾样品中添加一定含量的毒死蜱标准溶液,经过提取净化后上机测定,以不小于3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分别确定毒死蜱的检出限和定量限，分别为0.25 μg/kg和0.5 μg/kg。目前报道的水产品中毒死蜱检出限为0.5 μg/kg[10]和1.0 μg/kg[9],均高于本方法,说明本方法能够满足残留分析的要求。

2.4.2回收率和精密度

按1.3节描述进行前处理,向鲤鱼和克氏原螯虾样品中分别添加低、中、高(2.0、5.0、10.0 μg/kg)3个水平的毒死蜱标准溶液,每个添加水平做6个平行样品,进行加标回收试验。结果表明,鲤鱼中毒死蜱回收率为86.2%～102.9%,RSD为3.5%～7.6%;克氏原螯虾中毒死蜱回收率为98.6%～103.6%,RSD为4.1%～6.9%(见表2)。

表2 鲤鱼和克氏原螯虾中毒死蜱的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii (n=6)

2.4.3基质效应(ME)

按1.2节配制标准溶液,绘制溶剂标准曲线,线性方程为Y=116 420X-56 748,R2为0.999 1,鲤鱼和克氏原螯虾基质匹配标准曲线见2.4.1节。采用公式ME=[1-(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线斜率)]×100%,考察方法的基质效应[19]。如果ME值为负值,表明基质对信号有增强作用;如果ME值为正值,则基质对信号有抑制作用。结果表明,鲤鱼的ME值为23.7%,克氏原螯虾的ME值为19.2%,均大于15%,说明两种水产品基质对毒死蜱的质谱响应强度均呈轻微抑制作用,因此选择基质标准曲线进行定量计算。

2.5 实际样品的测定

按照该方法检测21份稻田养殖鲤鱼和62份稻田养殖克氏原螯虾,其中5份鲤鱼中检出毒死蜱残留,含量范围为8.95～43.68 μg/kg,检出率为23.8%。毒死蜱标准溶液(10 μg/L)、空白鲤鱼样品和阳性鲤鱼样品的总离子流色谱图见图4。

图4 标准溶液、空白鲤鱼和阳性鲤鱼样品中毒死蜱的总离子流色谱图Fig.4 Total ion current chromatograms of chlorpyrifos in a standard solution,a blank crap sample and a positive crap sample

3 结论

本文通过前处理条件和色谱条件的优化,建立了检测稻田水产品中毒死蜱残留的超高效液相色谱-串联质谱法。该方法操作简便,回收率高,重复性好,为稻田水产品中毒死蜱残留的风险监测、风险评估等提供了高效可靠的分析手段。