鞣花酸对顺铂引起小鼠急性肾损伤的影响

邓旭坤，付千，舒广文，郑燕，徐瑞,邱韵涵，段欢,余惠凡

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074;2 淮北职业技术学院 医学系，淮北235000；3 睢宁县人民医院 药剂科，徐州221200；4 湖北医药学院 武当特色中药研究湖北省重点实验室，十堰442000)

顺铂(cisplatin，CP)被广泛应用于治疗各种类型的癌症，包括睾丸癌、宫颈癌、颈癌和非小细胞肺癌等[1]，但其诱发的耳毒性、神经毒性、恶心、呕吐和肾毒性等副作用严重限制了其在临床上的应用，尤其是肾毒性.顺铂致肾损伤机制仍尚未完全明确，但有报道发现几种机制涉及顺铂诱导的急性肾损伤，其中包括氧化应激、炎症和凋亡等[2].因此，从天然产品中获得安全的活性化合物并将其用于预防和治疗顺铂诱导的急性肾损伤具有重要意义.

鞣花酸(Ellagic acid, EA)是一种源自于富含多酚鞣质的各种坚果软果，如石榴、五倍子、覆盆子、蓝莓、树莓、黑莓等植物组织中的天然多酚化合物[3].具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗肝损伤[6]、抗菌[7]、抗突变和抗病毒[8]等多种药理作用，广泛应用于食品、化妆品、医药等领域.目前国内外对鞣花酸相关肾损伤的保护作用研究甚少.本文旨在探究鞣花酸对顺铂引起的小鼠肾损伤的影响及其可能机制，为临床上预防和治疗顺铂引起的肾毒性提供参考.

1 材料与方法

1.1 动物、试药和仪器

8周龄雄性昆明种小鼠32只，(22±2)g，购自湖北省疾病预防控制中心，实验动物生产许可号：SCXK(鄂)2015-0003.小鼠每天给予充足的水和饲料，1周后开始实验.

顺铂(山东齐鲁制药，批号:7F013A89)；鞣花酸(EA,纯度98%，宝鸡市辰光科技)；兔单克隆Bax、Bcl-2、鼠抗 β-肌动蛋白单克隆抗体(Proteintech Group)；Hoechst 33258、Tunel试剂盒(Beyotime Co.Ltd)；肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、微量还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物研究所)；肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素1β(IL-1β)试剂盒(Beyotime Biotechnology).

多功能酶标仪(SMP-R8，北京维德维康)；电子天平(TX223L型,日本岛津)；低温高速离心机(FC5515R型，旭日实验仪器)；超声波清洗器(YQ-010型，上海易净)；微型旋涡混合仪(XH-C，旭日实验仪器)；低速离心机(TD5Z型，常州市金坛高科仪器厂)；脱色摇床(WD-9405C，北京市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11，B北京市六一仪器厂).

1.2 动物造模

取雄性昆明小鼠32只，随机分为对照组、模型组、EA给药组(10, 30 mg/kg)，每组8只.对照组小鼠灌胃生理盐水，持续10 d.给药组连续灌胃不同剂量鞣花酸7 d，第7天给药2 h后，除对照组外均单次腹腔注射顺铂(25 mg/kg)，给药组再灌胃3 d.摘取眼球取血离心得到血清并立即处死小鼠，取出肾脏称重并记录(冰上进行所有操作)，左肾放入组织固定液中，用于组织病理学等检查；右肾用于氧化应激指标及Western bolting等测定.

1.3 肾指数、体重变化及尿蛋白的测定

每日记录小鼠给药前体重，实验结束后计算体重变化.给予顺铂3 d后收集小鼠尿液并称重，将小鼠肾脏于冰生理盐水中洗净并记录其重量，计算小鼠的脏器指数：脏器指数/%=脏器重量/最终体重×100.用Bradford法检测尿蛋白浓度.

1.4 肾功能指标、TNF-α和 IL-1β含量测定

参照文献[9]将刚取出的血液放置于室温，待其凝固后于3000 r/min 离心10 min，分离血清.试剂盒检测Cr和BUN含量；ELISA试剂盒测定血清中TNF-α和IL-1β的含量.根据试剂盒说明测定其相关OD值，绘制标曲并计算含量.

1.5 肾组织中GSH和T-SOD含量的测定

将小鼠右肾在冰生理盐水中反复冲洗，按肾组织重量(g)∶生理盐水体积(mL)=1∶9 的比例制成10%匀浆液，3000 r/min，离心10 min，取上清液按照各测试盒操作方法测定T-SOD和GSH含量.

1.6 Western blotting检测Bax和Bcl-2表达

将肾组织放入RIPA裂解液中提取肾组织总蛋白，再加入5×上样缓冲液[V(裂解液)∶V(缓冲液)=4∶1]，沸水煮5 min使其变性.在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离蛋白质.将蛋白质转移到PVDF膜上.室温下，将转好的PVDF膜与5%的脱脂奶粉一起孵育来来阻断非特异性结合.用TBST洗涤3次并与Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一起室温孵育2 h.用TBST洗涤4次后，将膜与山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶1000)室温下孵育1 h. TBST洗膜后，用BeyoECL Plus A液和B液按1∶1混匀进行显色，Image J 分析软件定量和分析蛋白质条带的密度.

1.7 肾组织病理形态学检查

将肾组织固定在10%福尔马林溶液中并包埋于石蜡中，将固定好的组织进行切片，厚度4～5 μm.按照标准的方法用苏木精-伊红(HE)进行染色,滴加中性树胶封片，200×显微镜下观察、拍照.

1.8 Tunel检测

取肾组织石蜡切片，切片在65 ℃干燥1 min后进行常规脱蜡水化，轻轻将切片表面的蒸馏水拭干，37 ℃下蛋白酶K消化30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，细胞通透后加Tunel反应液并按试剂盒说明进行操作.待PBS洗涤后，再参照DAPI试剂盒进行染色，荧光显微镜下观察(×200).

1.9 数据分析

2 结果

2.1 EA对肾损伤小鼠体重、肾指数的影响

EA对肾损伤小鼠体重、肾指数的影响结果见表1.由表1可见：与对照组相比，模型组小鼠体重显著下降，肾脏指数显著增大(P<0.001)，说明肾脏受损肿大；与模型组相比，EA预防后能明显改善小鼠体重和肾脏指数的变化(P<0.01或P<0.001)，并呈一定的量效关系.

表1 EA对肾损伤小鼠体重、肾指数的影响Tab.1 Effect of EA on body weight, kidney index in mice with renal injury

注：与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001

2.2 EA对肾损伤小鼠肾功能的影响

EA对肾损伤小鼠肾功能的影响结果见图1.由图1可见：与对照组比较，模型组小鼠尿量明显减少，尿蛋白、BUN和Cr显著增高(P<0.001)，表明顺铂引起的肾损伤造模成功；与模型组比较，EA组小鼠尿量增多，尿蛋白、BUN和Cr明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，并呈现一定的量效关系.

与对照组比较，##P<0.01,###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001图1 EA对肾损伤小鼠肾功能的影响Fig.1 Effect of EA on renal function in mice with renal injury

2.3 EA对肾损伤小鼠TNF-α和IL-1β水平的影响

EA对肾损伤小鼠TNF-α和IL-1β水平的影响结果见表2.

表2 EA对肾损伤小鼠TNF-α和IL-1β水平的影响Tab.2 Effect of EA on the levels of TNF-α and IL-1β in mice with renal injury

注：与对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，

**P<0.01，***P<0.001

由表2可见：与对照组相比，模型组小鼠炎症相关因子TNF-α和IL-1β水平明显升高(P<0.01或P<0.001)；而与模型组相比，EA给药后能够降低炎症相关因子的水平(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，差异具有统计学意义.说明EA能够通过抑制炎症因子的表达来改善顺铂引起的肾损伤.

2.4 EA对肾损伤小鼠肾组织中GSH和T-SOD含量的影响

EA对肾损伤小鼠肾组织中GSH和T-SOD含量的影响结果见图2.由图2可见：与对照组相比，模型组小鼠在注射顺铂后肾组织中GSH和T-SOD含量显著减少，MDA含量显著升高(P<0.01或P<0.001)；与模型组相比，EA预防后GSH和T-SOD含量明显增高，MDA含量明显降低(P< 0.05或P< 0.01).说明EA能够通过改善抗氧化水平从而改善顺铂引起的肾损伤.

与正常组比较，##P<0.01,###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01图2 EA对肾损伤小鼠肾组织中和GSH、T-SOD和MDA含量的影响Fig.2 Effect of EA on the contents of GSH,T-SOD and MDA in renal tissues of mice with renal injury

2.5 EA对肾损伤小鼠肾组织病理变化影响

EA对肾损伤小鼠肾组织病理变化影响结果见图3.由图3可见：对照组肾组织中正常的肾小球和肾小管，无变性和坏死以及白细胞浸润等病理现象；而模型组小鼠肾脏中出现了肾小管扩张和变性，管间出血，肾小球充血肿胀及大量白细胞浸润；相比模型组，顺铂引起的病理变化在EA的预防下均获得了剂量依赖性抑制.说明EA的预防对肾组织的病理损伤具有明显的改善作用.

图3 EA对肾损伤小鼠肾组织中病理变化的影响(×200)Fig.3 Effect of EA on the pathological changes in renal tissues of mice with renal injury(×200)

2.6 EA对肾损伤小鼠细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

EA对肾损伤小鼠细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响结果见图4.由图4可见：促凋亡蛋白(Bax)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)是细胞凋亡中重要的因子，与对照组相比，模型组小鼠肾组织中Bax 蛋白表达明显增加(P<0.01)，Bcl-2的表达显著下降(P<0.01)；与模型组相比，EA预防后Bax蛋白表达明显下降(P<0.05)，Bcl-2 表达升高(P<0.01)，但均未恢复到正常水平.

与正常组比较，##P<0.01,与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01图4 EA对肾损伤小鼠细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Fig.4 Effect of EA on the expression ofBcl-2 and Bax protein in cell of mice with renal injury

2.7 EA对肾损伤小鼠肾组织中细胞凋亡的影响

EA对肾损伤小鼠肾组织中细胞凋亡的影响结果见图5.图5中Tunel染色结果表明：对照组基本无红色荧光的细胞核，说明无凋亡细胞；而顺铂造模后明显可见大量破碎的细胞核，凋亡细胞较对照组明显增多；EA预防后凋亡细胞较模型组显著减少，说明EA能够通过抑制细胞凋亡改善顺铂诱导的肾损伤.

图5 EA对肾损伤小鼠肾组织中细胞凋亡的影响(×200)Fig.5 Effect of EA on apoptosis in renal tissues of mice with renal injury(×200)

3 讨论

肾脏是机体生成尿液，清除代谢产物、毒物，保证机体内环境稳定的重要器官.顺铂是治疗癌症的首选药物之一，但在治疗癌症时会在近端肾小管细胞中积累，诱发严重的肾毒性[10].因此，研发能保护顺铂诱导的肾毒性的天然药物至关重要，本文研究了EA对顺铂引起急性肾损害的保护作用.

BUN、Cr和尿蛋白是临床上常用的肾功能相关指标，可通过肾小球滤过功能的损害程度来反映肾功能状态和肾脏损伤状况.研究结果表明：小鼠注射顺铂后BUN、Cr和尿蛋白水平显著升高，炎症相关因子TNF-α和IL-1β 水平明显上升，非酶抗氧化剂GSH和T-SOD含量显著降低，脂质过氧化主要产物MDA含量显著升高，表明顺铂引起的肾损伤模型构建成功；在损伤的同时出现了炎症反应和氧化应激，组织病理学检查的结果进一步支持了生化检测的结论.EA预处理均能改善这些指标，说明EA预处理后部分恢复了肾脏功能，并能抑制顺铂引起的炎症并破坏肾脏的抗氧化防御机制.

研究报道[10]顺铂诱导的肾毒性主要发生在近端肾小管上皮细胞中，可导致细胞凋亡.本实验结果显示：腹腔注射顺铂后，在小鼠的肾组织中顺铂显著增加了促凋亡蛋白Bax并降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平；EA给药后，Bax蛋白表达减少和Bcl-2蛋白表达增加，表明EA是通过抑制肾小管上皮细胞的凋亡来抑制顺铂引起的肾损伤.Tunel检测结果进一步证明了EA可通过抑制细胞凋亡来改善顺铂的肾损伤.

综上，EA对顺铂引起的肾损伤具有保护作用，其机制主要与EA的抗氧化、减少炎症反应和抑制肾小管上皮细胞凋亡有关.