干预措施对噪声污染大鼠脑组织基因表达及去甲肾上腺素水平的影响

俞发荣,李建军,YU Xin ,连秀珍,谢明仁,*,李登楼,陈望军,郭蕴萱

1.甘肃政法学院 甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室,兰州730070

2.University of Southern California,Los Angeles 90033,USA

0 前言

随着人们物质文化生活水平的日益提高,噪声污染对人类与生物界影响日趋严重[1]。噪声信号激发并引起听觉系统的兴奋,通过杏仁核激发下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA-轴) 释放应激激素[2],促进去甲肾上腺素(NA)的合成释放,较高浓度的NA 一方面使机体出现精神紧张和内分泌系统失调,导致组织器官的损伤[3],另一方面激活去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)回收运转NA,加速NA 的合成。中枢及周围神经系统的神经元受损时,脑组织内的脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophic factor,BDNF) 和其高亲和力受体-酪氨酸激酶受体 B(tyrosine kinase B,TrkB)水平发生变化,防止神经元受损死亡,改善神经元的病理状态,促进受损伤神经元再生及分化等生物效应,维持中枢及周围神经系统的神经元生存及正常生理功能。为了进一步探索引起脑组织损伤的噪声强度和NA、Nat、BDNF、TrkB 水平的关系,寻找预防噪声污染对组织损伤的干预措施和方法,用Wistar 为实验对象,给予国家规定的环境噪声排放标准以内的噪声,观察对脑组织中基因表达的影响,为环境治理和环境保护以及政府主管部门制定预防和控制噪声污染措施提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级Wistar 大鼠50 只,体重180—190 g,6周龄,雌雄各半。来源于甘肃中医药大学科研实验中心【SCXK (甘)2015—0001】,实验在甘肃政法学院SPF 级实验室进行【SYXK (甘)2015—0006】。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》规定,按3R 原则给予实验动物使用的人文关怀(伦理委员会审批号码:GZF—2017—006)。

1.1.2 试剂与仪器

去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)、去甲肾上腺素转运蛋白(noradrenaline transporter,NAt)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase B,TrkB)试剂盒,购于北京索宝生物科技有限公司;利血平(reserpine),广东邦民制药厂有限公司;UFX7103 AAW 音频信号发生器,上海电子教学仪器厂;TES—1352S 低频声计仪,泰仕电子工业股份有限公司;MK3-酶标仪,上海仪器有限公司;噪声刺激盒自制[4]。

1.2 实验方法

全部动物在SPF 级实验室IVC 饲育笼内饲养(笼内温度23℃ ± 1 ,℃ 湿度55%),每笼2 只,自由饮水进食,自然光照,适应7 d。按抓阄法将Wistar 大鼠分为5 组,每组10 只大鼠(雌雄各半)。空白对照组:不给噪声刺激,在实验当天早上灌胃蒸馏水10 mL·kg-1体重;噪声污染组(分为30、60、80 dB 三个组):在实验当天早上灌胃蒸馏水10 mL·kg-1体重,每天15:30 开始,分别将各组大鼠放入自制的噪声刺激盒给予相应的噪声刺激,每组每次30 min,每天1 次;干预组(利血平+80 dB):在实验当天早上按利血平半数致死量(LD50)的 1/100(用无菌水配制,20 mg·L-1),灌胃(20 mL·L-1体重),下午给予80 dB 的噪声刺激。连续刺激15 d。实验第16 天,全部动物用乙醚麻醉,无痛打开颅腔,取脑,放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.4)固定液固定24 h,参照大鼠脑立体定位图谱[5],切取大脑前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)、海马(hippocampus,Hipp)组织各5 mg,研磨成匀浆,3000 r·min-1离心20 min,取上清用去甲肾上腺素(NA)、去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)、脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B(TrkB)试剂盒测定其吸光度(OD)。分别以NA、NAt、BDNF 、TrkB 标准液浓度为横坐标,吸光度(OD)为纵坐标做标准曲线和标准曲线的直线回归方程。分别将各组大鼠脑组织吸光度值代入直线回归方程,计算出NA、NAt、BDNF、TrkB 水平。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 17.0 软件进行统计学处理。组间差异采用单因素方差分析,用均数±标准差(±s)表示,噪声污染对大鼠脑组织NA、NAt、BDNF、TrkB 水平的影响程度用百分比表示,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 利血平对噪声污染大鼠脑组织去甲肾上腺素(NA)水平的影响

NA 标准曲线的直线回归方程为:Y=3.2×10-3x+1.34×10-2,R2=0.9989。分别将30、60、80 dB 组 脑组织吸光度(OD)代入方程,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)NA 水平比对照组分别升高了29.62%、76.96%、93.57%和15.29%、55.08%、70.13%;先给予利血平再给予80 dB 噪声刺激,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)NA 水平比对照组分别降低了46.71%和62.06%;(图1)。

2.2 利血平对噪声污染大鼠脑组织去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)水平的影响

NAt 标准曲线的直线回归方程为:Y=1.4 ×10-3x+ 1.69×10-2,R2=0.9993;分别将30、60、80 dB 组脑组织吸光度(OD)代入方程,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)NAt 水平比对照组分别升高了22.87%、50.35%、94.65%和12.00%、31.76%、61.83%;先给予利血平再给予80 dB 噪声刺激,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)NAt 水平比对照组分别降低了33.66%和52.06%,(图2)。

2.3 利血平对噪声污染大鼠脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)水平的影响

BDNF 标准曲线的直线回归方程为:Y=1.0×10-3x+ 1.33×10-2,R2=0.9986;分别将30、60、80 dB 组脑组织吸光度(OD)代入方程,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)BDNF 水平比对照组分别升高了24.87%、39.27%、67.41%和44.97%、80.81%、95.84%;先给予利血平再给予80 dB 噪声刺激,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)BDNF 水平比对照组分别升高了16.36%和14.34%,升高程度明显低于噪声污染组,(图3)。

图1 利血平对噪声污染大鼠脑组织去甲肾上腺素(NA)水平的影响 Figure1 Effect of reserpine on NA levels in brain tissue of noise-contaminated rats( note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group).

图2 利血平对噪声污染大鼠脑组织去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)水平的影响 Figure2 Effect of reserpine on NAt levels in brain tissue of noise-contaminated rats(Note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.

图3 利血平对噪声污染大鼠脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)水平的影响 Figure3 Effect of reserpine on BDNF levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

2.4 利血平对噪声污染大鼠脑组织酪氨酸激酶受体B(TrkB)水平的影响

TrkB 标准曲线的直线回归方程为:Y=1.1×10-3x+ 1.19×10-2,R2=0.9993。分别将30、60、80 dB 组脑组织吸光度(OD)代入方程,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)TrkB 水平比对照组分别升高了32.64%、59.95%、82.64%和31.02%、57.31%、80.23%;先给予利血平再给予80 dB 噪声刺激,大鼠大脑前额叶皮质(PFC)和海马(Hipp)TrkB 水平比对照组分别升高了4.75%和10.52%,升高程度明显低于噪声污染组,(图4)。

3 讨论

图4 利血平对噪声污染大鼠脑组织酪氨酸激酶受体B(TrkB)水平的影响 Figure4 Effect of reserpine on TrkB levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note.*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

噪声污染直接和间接影响着人们的身心健康和生活质量[6],增加人们精神和心理压力[7],引起人们,尤其是儿童睡眠障碍,睡眠不足会导致内分泌和代谢紊乱[8]。噪声对神经系统的不良影响与噪声强度呈剂量-依赖关系[9],噪音不仅导致听力障碍[10],还能引起高血压[11]、缺血性心脏病[12],导致人们情绪波动、恐惧和精神疾病[13]。流行病学调查结果表明,65 dB(A)以上的噪声可增加冠心病发病率[14]和患心血管疾病的风险[15],增加死亡率[16]。噪声污染提高交感神经兴奋性,使血压升高[17],当噪声水平为50 dB 时,通过应激反应使肾上腺素和去甲肾上腺素水平升高,血管收缩导致血压升高,增加心肌梗死的风险[18]。神经生理学研究表明,脑内去甲肾上腺素能神经元胞体通过纤维投射分布到下丘脑、海马和额叶等脑区。给予大鼠单胺氧化酶抑制剂,提高了突触间的去甲肾上腺素(NA)浓度,去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)的表达也随之增加[19]。NAt 作为交感 神经突触前膜上的一种微量膜蛋白,其功能是将神经元释放的NA 再摄取回突触前膜中,调控突触间隙中的NA浓度,终止神经冲动信号,维持受体对神经递质的敏感性。NAt 是交感神经神经递质信号传导的重要环节,在维持正常心血管系统正常功能发挥重要作用。实验结果发现,在噪声的刺激下,去甲肾上腺素(NA)、去甲肾上腺素转运蛋白(NAt)、脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B(TrkB)水平均升高,与噪声强度呈剂量-依赖关系。结果说明,随着噪声强度的增加,脑组织内去甲肾上腺素升高,引起去甲肾上腺素转运蛋白活性增加,将去甲肾上腺素摄取运回突触前膜,维持突触间去甲肾上腺素正常水平;脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶受体B 水平升高,保护脑组织细胞免受噪声损伤。当给予利血平后,去甲肾上腺素水平明显降低或耗竭。结果提示,去甲肾上腺素(NA)是噪声污染引起脑组织器官损伤的体内主要因素,脑源性神经营养因子和酪氨酸激酶受体B 防止神经元受损死亡,改善神经元的病理状态,利血平使去甲肾上腺素耗竭,保护组织器官免受噪声污染的损伤。