吡格列酮对A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞18F-FDG摄取影响的实验研究

秦露平 吕杰 李建芳 谢良骏 蒋永泺 程木华

【摘要】目的 探討吡格列酮对A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）摄取的影响。方法 用不同浓度（0、10、20、50、100、200 μg/ml）的吡格列酮溶液分别作用于A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞1 h，加入18F-FDG孵育0.5 h后，用γ计数仪分别检测细胞18F-FDG摄取变化情况。用100 μg/ml的吡格列酮作用细胞1 h，加入18F-FDG分别孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，并以0 μg/ml吡格列酮溶液作用细胞作为对照组，用γ计数仪分别检测以上6个时间点细胞18F-FDG摄取变化情况，获得每分钟放射性计数（CMP）百分比。结果 吡格列酮浓度为10、20、50、100、200 μg/ml组A549肺癌细胞CMP百分比均高于0 μg/ml组（P均< 0.05）。吡格列酮浓度为10、20、50 μg/ml组巨噬细胞CMP百分比与0 μg/ml组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），吡格列酮浓度为100、200 μg/ml组RAW264.7巨噬细胞的CMP百分比均低于0 μg/ml组（P均< 0.05）。在6个不同时间点，经吡格列酮作用后，肺癌细胞CMP百分比均高于对照组（P均< 0.001），而巨噬细胞CMP百分比均低于对照组（P均< 0.05）。结论 较大剂量吡格列酮短期内能使A549肺癌细胞18F-FDG摄取增高，而使RAW264.7巨噬细胞的18F-FDG摄取减低。

【关键词】吡格列酮;肺癌细胞;巨噬细胞;氟代脱氧葡萄糖

【Abstract】Objective To evaluate the effect of pioglitazone on the 18F-fluorodeoxyglucose （18F-FDG） uptake in the A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages.  Methods The A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages were treated with different concentrations of pioglitazone solutions （0， 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml） for 1 h. After incubation with 18F-FDG for 0.5 h， the uptake of 18F-FDG was detected by a γ counter. The cells were treated with 100 μg/ml pioglitazone for 1 h and incubated with 18F-FDG for 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 and 3.0 h， respectively. The cells untreated with pioglitazone were assigned into the control group. The changes of the 18F-FDG uptake at 6 time points were detected by a γ counter. The percentage of radioactive count per minute （CMP） was calculated.  Results The percentage of CMP in the A549 lung cancer cells treated with 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly higher than that in the cells without pioglitazone treatment （all P< 0.05）. The percentage of CMP did not significantly differ between the RAW264.7 macrophages treated with 10， 20 and 50 μg/ml of pioglitazone and those untreated with pioglitazone （all P> 0.05）. The percentage of CMP in the RAW264.7 macrophages treated with 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly lower than that in those without pioglitazone treatment （both P< 0.05）. At 6 time points， the percentage of CMP in the lung cancer cells treated with pioglitazone was considerably higher than that in the control group （all P< 0.001）， whereas the percentage of CMP in the macrophages treated with pioglitazone was significantly lower compared with that in the control group （all P< 0.05）.  Conclusion Treatment with a large dose of pioglitazone can increase the short-term 18F-FDG uptake in the A549 lung cancer cells， whereas decrease the 18F-FDG uptake in the RAW264.7 macrophages.

【Key words】Pioglitazone;Lung cancer cell;Macrophage;18F-fluorodeoxyglucose

正电子发射断层显像/X线计算机体层成像（PET/CT）自问世之后，在肺癌的诊断、鉴别诊断、临床分期、疗效监测等应用多年。目前临床应用广泛的肿瘤示踪剂是氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG），但18F-FDG 在炎性病变也能被明显摄取，因此其对于肺癌的鉴别诊断存在一定困难。炎性病变的病理生理机制非常复杂，不同病理阶段有许多中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润。这些炎性细胞往往与肿瘤细胞在糖代谢途径方面存在相类似的多重机制，导致炎性细胞能像肿瘤细胞一样高度摄取葡萄糖[1]。吡格列酮是临床较常用的抗2型糖尿病药物，作为一种过氧化物酶增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激动剂，能通过激动PPAR-γ增强胰岛素敏感性以提高机体对葡萄糖的摄取，同时能抑制炎症反应[2-5]。本研究以此为出发点，在体外细胞试验角度，研究吡格列酮对A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞葡萄糖代谢的影响，观察吡格列酮介入后2种细胞的糖代谢是否发生不同反应，从而对两者进行鉴别。

材料与方法

一、材 料

A549肺癌细胞株来源于上海科学院细胞库，RAW264.7 小鼠巨噬细胞株来源于中国医学科学院基础医学院研究所基础医学细胞中心。DEME高糖培养基、DEME无糖培养基、新生胎牛血清、0.25%胰酶+依地酸二钠（EDTA）、磷酸盐缓冲液（PBS）均由广州杰特韦公司提供，二甲亚砜溶剂由凯基生物公司提供。吡格列酮粉剂（纯度≥98%）由佑佰生物公司提供。18F-FDG由广州原子高科同位素有限公司提供。24孔板由Corning有限公司提供。Galaxy48R CO2培养箱由美国Eppendorf公司提供。γ放射性计数仪（型号GC-1200）由北京华瑞森科技发展有限公司提供。

二、方 法

1. 细胞培养与种板

A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞均用含10%胎牛血清的DEME高糖培养基培养，于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，2 ～ 3 d传代1次。将密度约2×105/ml的细胞悬液接种于24孔板，每孔接种的细胞悬液体积为0.5 ml，每种细胞分为若干组，每组均为6孔。经过约2 d的培养，待细胞长满80%视野时，可以开始进行相关处理。

2. 不同浓度吡格列酮对细胞18F-FDG摄取的影响试验

先用0、10、20、50、100、200 μg/ml吡格列酮溶液分别作用于A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞30 min，然后加入放射性活度为37 MBq的18F-FDG放入培养箱孵化30 min。迅速吸掉上述培养基，用PBS洗涤2次，向清洗干净的培养板中加入胰酶消化获取细胞悬浮液。将细胞悬浮液置于γ计数仪进行放射性计数，记录校正后的细胞每分钟放射性计数（CMP）。

3. 不同时间点100 μg/ml吡格列酮对细胞 18F-FDG摄取的影响实验

将A549肺癌细胞及RAW264.7巨噬细胞加入0 μg/ml吡格列酮溶液（对照组）作用1.0 h，同时加入18F-FDG分别孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，分别检测6个不同时间点2种细胞的CMP。将上述2种细胞加入100 μg/ml吡格列酮溶液（吡格列酮组）作用1.0 h，同时加入18F-FDG孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分别检测6个不同时间点2种细胞的 CMP。

三、CMP百分比

本研究中，细胞对18F-FDG的摄取以CMP百分比表示。CMP百分比（%）=细胞CMP/18F-FDG孵育0.5 h时吡格列酮浓度为0 μg/ml组的细胞平均CMP×100%，即CMP百分比（%）=CMP/平均CMP0×100%。

四、统计学处理

应用GraphPad Prism进行统计分析。计量资料采用表示;不同浓度吡格列酮对细胞18F-FDG摄取的影响采用单因素方差分析，多重比较方法采用Dunnett-t检验;不同时间点100 μg/ml吡格列酮对细胞18F-FDG摄取的影响实验采用重复测量资料方差分析，因时间因素与组间因素存在交互作用，因此采用t检验分析单独效应。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同浓度吡格列酮对细胞18F-FDG摄取的影响

不同浓度吡格列酮作用于A549肺癌细胞的CMP百分比比较差异有统计学意义（F=32.76，P < 0.001），其中吡格列酮浓度为10、20、50、100、200 μg/ml组A549肺癌细胞的CMP百分比均高于0 μg/ml组（P均< 0.05）。

不同浓度吡格列酮作用于RAW264.7巨噬细胞的CMP百分比比较差异有统计学意义（F=6.84，P< 0.05），其中吡格列酮10 μg/ml组、20 μg/ml组、50 μg/ml组RAW264.7巨噬细胞的CMP百分比与0 μg/ml组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），吡格列酮浓度为100 μg/ml、200 μg/ml組巨噬细胞的CMP百分比均低于0 μg/ml组（P均< 0.05）。

二、不同时间点100 μg/ml吡格列酮对细胞 18F-FDG摄取的影响

吡格列酮与时间的交互作用对A549肺癌细胞CMP百分比的影响有统计学意义（F=10.73，P < 0.001）;单独效应显示：各时间点吡格列酮组A549肺癌细胞的18F-FDG摄取均高于对照组（t为10.92～20.43，P均< 0.001）。吡格列酮与时间的交互作用对RAW264.7巨噬细胞CMP百分比的影响有统计学意义（F=7.46，P < 0.001）;单独效应显示：各时间点吡格列酮组RAW264.7巨噬细胞的CMP百分比均高于对照组（t为3.22～10.28，P均< 0.05）。

讨论

PET/CT对于肺癌与肺炎性病变的鉴别诊断一直是临床的一大难题。目前，无论是应用不同类型PET显像剂，还是PET目测法或半定量分析，又或者是PET延迟显像的应用，均不能较好地鉴别肺癌与肺炎性病变[6]。吡格列酮不仅具有抗2型糖尿病效应，还具有抗炎效应。其介入后是否能使肺癌及肺炎性病变糖代谢发生不同改变，从而通过PET/CT鉴别两者？国内外有较多关于吡格列酮在糖尿病及脂质代谢等方面的研究，但关于PET/CT吡格列酮介入鉴别肿瘤与炎性病变方面的研究有限。因此，本研究从细胞学角度，探究肺癌细胞及巨噬细胞经吡格列酮介入后各自糖代谢发生的改变，尝试通过不同的糖代谢改变鉴别2种细胞。

本研究首先探索了不同浓度的吡格列酮溶液对2种细胞18F-FDG摄取的影响，研究结果与Cheong等[7]研究基本一致，显示吡格列酮短期内能使肺癌细胞CMP百分比增高，而较大剂量吡格列酮能使巨噬细胞CMP百分比减低，因此较大剂量吡格列酮能使肺癌细胞与巨噬细胞糖代谢产生不同效应。在研究肺癌细胞与巨噬细胞动态18F-FDG摄取中，2种细胞放射性摄取-时间曲线呈先增高后降低的抛物线趋势，两者在体外18F-FDG摄取的高峰时间约为1.5～2 h;而文献显示人巨噬细胞在3 h内18F-FDG摄取呈线性增高趋势，这种细胞动态18F-FDG摄取的差异可能与选取不同的细胞株类型相关[8]。本研究中，对照组肺癌细胞与巨噬细胞动态CMP百分比的变化情况相差不大，仅利用细胞动态18F-FDG 摄取的变化可能无法鉴别肺癌细胞与巨噬细胞，这可能是临床PET/CT多时相或延迟显像无法鉴别部分肺癌与肺炎性病变的重要原因之一。通过浓度为100 μg/ml吡格列酮的介入后，2种细胞18F-FDG摄取-时间曲线仍呈抛物线趋势，18F-FDG 摄取高峰时间基本相同，但吡格列酮组的肺癌细胞CMP百分比均高于对照组，吡格列酮组的巨噬细胞CMP百分比却均低于对照组。有文献显示，吡格列酮具有抑制肿瘤细胞生长及促进其凋亡的作用，生长受抑制的肿瘤细胞糖代谢将减低[9-10]。本研究显示，吡格列酮介入后肺癌细胞18F-FDG摄取增高或糖代谢增高。其主要原因可能与吡格列酮作用时间长短有关，本研究中的吡格列酮作用時间只有1 h，而使肿瘤细胞生长抑制至少需要1 d以上时间。因此，本研究在体外细胞试验证实吡格列酮短期介入后可使肺癌细胞与巨噬细胞糖代谢发生不同改变，通过这种变化可以将肺癌细胞与巨噬细胞鉴别开来。尽管如此，本研究仅立足于体外细胞试验，而且肺癌及炎性细胞类型有限，是否其他种类肺癌细胞及炎性细胞经吡格列酮介入后糖代谢会发生不同改变，活体动物试验结果是否与体外细胞实验结果一致，以及吡格列酮所致细胞糖代谢改变的分子机制等问题将值得进一步深入研究。

综上所述，体外细胞试验显示较大剂量吡格列酮短期介入后，A549肺癌细胞18F-FDG摄取增高，而RAW264.7巨噬细胞的18F-FDG摄取减低。

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（收稿日期：2018-10-18）

（本文编辑：林燕薇）