TAM受体检测评估COPD患者严重程度的研究

李富荣，樊瑞军，邓 丽

(宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心，宁夏银川 750002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续气流受限为主要特点的呼吸道疾病，近年来病死率显著上升，在全球范围内居死亡原因的第4位[1]。COPD发生常伴自主呼吸功能差、咳嗽、哮喘等气道炎性反应及意识障碍、嗜睡等精神症状，且极易引发呼吸睡眠障碍、慢性呼吸衰竭、慢性肺源性心脏病和自发性气胸等并发症，严重影响患者生活质量[2]。既往研究显示[3]，COPD发生、发展与细胞凋亡密切相关。且病理学研究认为[4-5]，COPD患者肺内凋亡细胞数量随巨噬细胞对凋亡细胞吞噬能力的减弱而大量增加，导致凋亡细胞聚集于肺内而不能及时清除，从而造成凋亡细胞继发性坏死，致使机体发生炎性反应。目前，临床上评估COPD严重程度的血浆标志物较少，TAM受体是一个受体酪氨酸激酶(RPTKs)亚家族，Tyr03、Mer、Axl为其成员且结构相似，具有共同的配体S蛋白与生长停滞特异性蛋白6(Gas6)。作为吞噬凋亡细胞的重要调节蛋白，TAM受体及其配体具有介导细胞黏附及吞噬，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的生理功能，并在机体免疫调节过程中发挥关键作用。KHAN等[6]采用动物模型探讨发现Tyr03、Mer、Axl基因敲除后AM/小鼠肺内凋亡细胞数量明显增多，发生自发性的自身免疫性肝炎，表明TAM受体为COPD凋亡清除过程中的血浆标志物。为此，本研究通过检测COPD患者血浆中Tyr03、Mer、Axl水平，旨在探讨COPD中TAM受体的表达与临床意义，以期为临床COPD治疗提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2018年1月宁夏回族自治区人民医院呼吸科收治的468例COPD患者作为COPD组，根据COPD全球倡议(GOLD)将其分为Ⅰ期(n=31)、Ⅱ期(n=107)、Ⅲ期(n=176)、Ⅳ期(n=154)，另收集同期本院400例体检健康者作为健康对照组。COPD组：男365例，女103例；年龄23～80岁，平均(70.28±9.37)岁。健康对照组：男294例，女106例；年龄25～82岁，平均(70.37±6.05)岁。COPD组与健康对照组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)；研究组第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积占预计计值的百分比(FEV1%)与健康对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD Ⅰ组 FEV1%与COPD Ⅱ组比较有统计学意义(P<0.05)；COPD Ⅱ组、COPD Ⅲ组体质量指数(BMI)及COPD Ⅲ组FEV1%与COPD Ⅳ组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD Ⅱ组 FEV1%与COPD Ⅲ组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

纳入标准：(1)诊断标准符合中华医学会呼吸病分会COPD学组2013年制订的COPD诊治指南[6]；(2)未合并混合性结缔组织病、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、急性特发性多神经炎；(3)本研究获得本院伦理委员会批准，同时入选患者均签署知情同意书；(4)患者住院资料详细；(5)心、肝、肾功能正常。排除标准：(1)合并肺结核、肺间质病、支气管扩张等其他肺部疾病；(2)合并类风湿关节炎、硬皮病、甲状腺自身免疫病等自身免疫性疾病；(3)患者对本次研究有异议；(4)妊娠或哺乳期妇女；(5)合并严重精神病或心血管、造血系统疾病；(6)合并恶性肿瘤疾病。

表1 两组一般资料比较

注：与健康对照组比较，aP<0.05；与COLD Ⅱ期比较，bP<0.05；与COLD Ⅳ期比较，cP<0.05；与COLD Ⅲ期比较，dP<0.05

1.2方法 (1)入院后抽取所有研究对象晨起空腹静脉血4 mL，1 000×g离心10 min，收集血浆于-80 ℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测COPD组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)及健康对照组血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平。ELISA具体步骤如下：在酶标包被板上设标准品孔10孔，用标准品稀释液梯度稀释标准品，稀释后各孔加入待测样品50 μL，37 ℃温育30 min。洗涤缓冲液洗涤5次，每孔加入酶标试剂50 μL，37 ℃温育30 min。洗涤缓冲液洗涤5次，先后加入显色剂A 50 μL、显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应(蓝色立转黄色)后15 min内以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。主要仪器试剂：碳酸盐包被缓冲液购自南京森贝伽生物科技有限公司；柠檬酸购自山东恒通生物科技公司；37 ℃孵育箱购自迪测生物科技有限公司；酶标板购自上海拜力生物科技有限公司；移液枪购自北京索莱宝科技有限公司；洗涤缓冲液购自连云港端峰生物科技有限公司；牛血清清蛋白购自上海西宝生物科技股份有限公司；无水乙醇购自湖北卓奥环保科技有限公司；98%浓硫酸购自广州市御和田化工科技有限公司。(2)分析COPD患者血浆中sAxl、sMer、sTyr03与临床指标的关系。

2 结 果

2.1COPD组与健康对照组血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平 COPD组血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2COPD组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平 COPD组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血浆中sTyr03水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；COPD组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血浆中sAxl、sMer水平依次下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 COPD组与健康对照组血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平比较

注：与健康对照组比较，aP<0.05

2.3COPD患者血浆中sAxl、sMer、sTyr03与临床指标相关性分析 血浆sAxl与COPD患者年龄、FEV1/FVC、BMI、FEV1%呈正相关关系，血浆sMer、sTyr03与患者FEV1%呈正相关关系。见表4、图1。

2.4COPD危险因素的Logistics回归分析 Logistics回归分析结果显示，COPD分期、sAxl、sTyr03、sMer为COPD的危险因素。见表5。

表3 COPD组各期血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平比较

注：与COPD Ⅰ期比较，aP<0.05；与COLD Ⅱ期比较，bP<0.05；与COPD Ⅲ期比较，cP<0.05

表4 COPD患者血浆中sAxl、sMer、sTyr03与临床指标的相关性分析P值

注：A为sAxl；B为sMer；C为sTyro3水平

图1 sAxl、sMer和sTyro3水平与COPD患者相关性散点图

3 讨 论

有文献报道[7]，TAM受体缺失的小鼠患有系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)等自身免疫病及慢性炎症，这与TAM受体信号通路介导的抑制天然免疫、清除凋亡细胞等密切相关。众所周知，COPD为一种呈进行性发展的慢性呼吸道疾病，其确切病因尚不清楚，以往研究报道其与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎性反应有关[8-10]。近期相关研究也报道[11]，免疫球蛋白A(IGA)、抗核抗体(ANA)、免疫球蛋白G(IGG)、抗肺上皮细胞抗体(AECA)、免疫球蛋白M(IGM)等多种自身抗体广泛参与COPD发病及病情进展，且COPD患者自身抗体在GOLD Ⅲ期和GOLD Ⅳ期的阳性表达率更高，进一步证实COPD发病及进展与自身免疫有关，且凋亡细胞清除不足现象常存在于自身免疫机制的形成过程中。

Tyr03、Mer、Axl具有调控免疫细胞分化、清除凋亡细胞的重要功能[12]，与其他相关文献报道相符[6-7]。血浆分泌型可溶性蛋白Mer、Tyr03、Axl与氨基端Gla域结合凋亡细胞膜上外翻的磷酯酰丝氨酸，可促进TAM受体的配体Gas6羧基端与单核吞噬细胞表面TAM受体结合，以介导巨噬细胞吞噬清除凋亡细胞。相关研究报道，COPD患者肺内凋亡细胞的大量增加使凋亡细胞不能被彻底清除，造成凋亡细胞继发性坏死，最终导致炎症发生[13-15]。因此，推测异常的TAM受体信号传导可能参与COPD发病过程。TAM受体在急性冠状动脉综合征(ACS)、原发性干燥综合征(PSS)、系统性红斑狼疮(SLE)等不同疾病中作用已经有相关研究。刘磊[16]发现S蛋白在SLE患者血浆中的水平显著下降，Gas6在SLE患者血浆中的水平则显著升高，且SLE患者Gas6与SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈显著负相关，而SLE患者S蛋白与SLEDAI无明显相关性。杨云娇等[17]研究发现，PSS患者Axl在信使RNA水平上显著低于健康对照者，PSS患者sMer在血浆水平上显著高于健康对照组，且sMer与PSS患者血浆IgG呈正相关。吴俊等[18]对ACS患者实施冠状动脉介入手术，发现ACS患者sMer、sTyr03水平均显著高于健康者，且ACS患者sMer与sTyr03呈正相关，提示sMer与sTyr03可能由丰富表达sMer、sTyr03受体的巨噬细胞产生，且Mer可介导巨噬细胞吞噬凋亡细胞，Mer受体缺失可能导致凋亡细胞聚集于肺内而不能及时清除，从而加速动脉粥样化(AS) 。

本研究以本院收治的468例COPD患者为研究对象，将其与400例健康对照者对比发现，健康对照组血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平明显高于COPD组，这与其他相关文献报道基本吻合[16-18]，提示sAxl、sTyr03、sMer在COPD发病过程中发生明显变化。同时，检测COPD 患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血浆中sAxl、sTyr03、sMer水平，发现COPD患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血浆中sTyr03水平无明显差异，且COPD组患者血浆中sAxl、sMer水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期依次显著性下降。分析其原因可能是随着COPD病情加重，大量凋亡细胞在COPD患者肺内聚集，结合凋亡细胞消耗过多，导致sAxl、sMer水平降低，提示sAxl、sMer可用于评估COPD严重程度。随后，分析COPD患者血浆中sAxl、sMer、sTyr03与临床指标的相关性时发现，血浆sAxl与COPD患者年龄、FEV1/FVC、BMI、FEV1%呈正相关关系，血浆sMer、sTyr03与患者FEV1%呈正相关关系。COPD病情越严重，sAxl、BMI越低，这与COPD患者Ⅳ期BMI显著低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期相符。为进一步探究sAxl、sTyr03、sMer在COPD中的检测意义，采用Logistic回归分析COPD危险因素时发现COPD分期、sAxl、sTyr03、sMer为COPD的危险因素。

4 结 论

综上所述，sAxl、sMer、sTyr03在COPD患者血浆中明显降低，且sAxl、sMer水平与COPD严重程度密切相关，sAxl、sMer TAM受体可作为评估COPD患者严重程度的标志物。但本研究为单中心小样本研究，仍需多中心大样本研究加以证实。