响应面法优化蒲公英总黄酮提取工艺及其抑菌活性

延 永，张亦琳，吴永玲，杨蓉蓉

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

蒲公英（Taraxacumspp.），菊科（Compositae），多年生草本植物，味微苦，平微寒，具有清肺利嗽、消肿散结和养阴凉血等功效[1]。研究表明，蒲公英具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆、保护胃肠道、调节免疫等多种功效[2]。但蒲公英口感不佳，难以添加到日常饮食中。经分析，蒲公英所含化学物质种类繁多，含有机酸、黄酮、挥发油、三萜类等[3-4]。蒲公英的药用价值与其所含黄酮类物质有着极大的关系[5]，对蒲公英进行深加工，提取其有效活性成分，在食品、保健品领域加以应用，具有非常重要的经济价值和现实意义[6]。目前，蒲公英提取的溶剂一般为醇类[7]、水[8]等大极性溶剂，提取手段有（加热）回流[9]、超声辅助[10]、微波辅助[11]等。综合对比，乙醇回流提取蒲公英总黄酮具有操作简便、毒性低、污染少、效率高的优点[12]。但是，目前的乙醇回流提取工艺并没有考虑浸泡对提取效果的影响，有研究表明，中药材经充分浸泡后再加热煎煮提取有效成分，有助于提高提取得率[13]。

基于此，本研究在传统回流提取工艺的基础上，首次增加溶剂浸泡环节，通过对提取各单因素进行分析和响应面试验优化，希望开发出方法简便、提取率高的蒲公英总黄酮提取工艺，并对提取物的抑菌活性进行研究，为蒲公英的开发利用提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙醇为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂；NaOH（片状）、Al（NO3）3、NaNO2均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；芦丁标准品(中国药品生物制品检定所）；蒲公英（四川峨眉山市售）。供试菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌由张亦琳博士提供。粉碎机（HK-02A，广州旭朗机械设备有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-755B，上海分析仪器总厂）；高压灭菌锅（YXQ-LS-18SI，上海博迅）；恒温恒湿培养箱（DHP-9052，上海华邻）。

1.2 试验方法

1.2.1 蒲公英总黄酮的提取方法

在250 mL的圆底烧瓶中加入蒲公英粉末（过60目筛）2.0 g，加入确定量溶剂后，浸泡，加热回流，待体系冷却后，过滤除去固体废弃物，滤液为蒲公英总黄酮提取液。

1.2.2 提取液中总黄酮含量测定方法

蒲公英总黄酮含量测定采用芦丁标准曲线法[14]，以吸光度值A为坐标轴Y，标准品浓度（C）为坐标轴X，绘制芦丁标准曲线，模拟回归方程：Y=10.88X-0.007 9，R2=0.998 4。测试样品在浓度0.01～0.08 g/L范围内呈良好的线性关系。

移取5.0 mL提取液于50 mL容量瓶，水定容后，移取1.0 mL至25 mL容量瓶，按照配置芦丁系列溶液的方法[14]处理样品。在吸光度510 nm处，测得吸光度，根据回归方程计算总黄酮浓度，总黄酮得率Y（%）由下式计算所得。

式中：Y-总黄酮得率（%）

C-总黄酮浓度（mg/mL）

N-稀释倍数

V-提取液取样量（mL）

W-药材投入粉末质量（mg）

1.2.3 蒲公英总黄酮提取的单因素（各因素）试验

按1.2.1方法提取蒲公英总黄酮，以乙醇体积分数（70%）、料液比（1∶30 g/mL）、浸泡时间45 min、回流时间2.5 h为基础水平，依次考察蒲公英总黄酮提取工艺中乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、浸泡时间 （15、30、45、60、75 min）、回流时间（1、1.5、2、2.5、3 h）各水平对得率的影响。考察单一因素影响时，其他因素水平与基础水平一致，以蒲公英得率为指标，绘制各试验因素对蒲公英总黄酮得率的影响曲线图。

1.2.4 蒲公英总黄酮提取的响应面试验优化

在单因素测试的基础上，确定响应面试验的因素水平（表1）。运用Box-Behnken响应面设计方案，优化蒲公英总黄酮提取工艺，以总黄酮得率Y（%）为相应参数，考察各因素水平对其提取的影响，并验证最佳工艺。

表1 Box-Behnken设计实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.5 MIC和MBC值的测定

参考文献方法[15-16]测定MIC和MBC值。将蒲公英总黄酮提取物配制成浓度0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL的系列溶液，灭菌条件下，分别量取10.0 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基、100.0 μL菌悬液（104～105CFU/mL）和1.0 mL配制的系列溶液于锥形瓶（50 mL）中。37℃、160 r/min条件下培养24 h后测量吸光度值A（λ=517 nm），当A=0时，对应的浓度为MIC值；37℃、160 r/min条件下培养48 h后测量吸光度值A（λ=517 nm），当A=0时，对应的浓度为MBC值[17]。

2 结果与分析

2.1 蒲公英总黄酮提取的单因素（各因素）试验结果

当乙醇浓度由50%增加到60%时，蒲公英总黄酮提取率大幅提升，在60%时达到顶峰（7.32%）（图1）。继续增加乙醇浓度，提取率出现下滑，可能是60%左右乙醇含量溶液的极性与黄酮的极性比较匹配，有利于黄酮类化合物的溶出；液料比达到1∶40（g/mL）时，提取率达到最大值7.31%。继续增大料液比蒲公英总黄酮提取率出现下降趋势，蒲公英含量过低不利于酮类化合物溶出；浸泡时间对提取率影响较大，浸泡时间太短不利于蒲公英黄酮的提取。分析发现最佳的浸泡时间应该在45 min左右，提取率达到最大值6.93%；回流时间对提取的影响与浸泡时间类似，提取率有明显增加的过程，2.5 h时，达到6.92%（峰值）。继续增加到3 h时，提取率下降，可能的原因是长时间的高温回流，破坏蒲公英黄酮的分子结构，以至于提取率减小。

2.2 蒲公英总黄酮提取的响应面试验结果

图1 各试验因素对蒲公英总黄酮得率的影响Fig.1 Effects of each experimental factor on yield of total flavonoids from Taraxacum

采用Design-Expert 8.0.6.1软件，以蒲公英总黄酮提取率为响应值（表2），进行二次响应面回归分析，得到如下回归方程。

总黄酮提取率=7.91+0.32A-0.068B+0.017C+0.024D-0.03AB-0.01AC-0.03AD-0.04BC-0.04BD+0.013CD-1.02A2-0.17B2-0.19C2-0.31D2

表2 蒲公英总黄酮提取率的响应面法实验结果Tab.2 Response surface method for extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

响应面模拟的模型高度显著（P＜0.001），方差分析表明该模型可靠性好，失拟不显著，实验测量值与模型预测值基本一致，R2=0.985 5（表3）。变异系数CV=1.30，说明试验可操作性较好。应用该模型充分拟合实验数据，发现蒲公英总黄酮的提取率变化与所选变量相关，其中乙醇体积分数（A）是高度相关（P＜0.001），料液比（B（显著相关（P＜0.05）。在模型模拟范围内，各因素对蒲公英总黄酮的提取率影响程度大小的顺序为乙醇体积分数（A）＞料液比（B）＞回流时间（D）＞浸泡时间（C）。

表3 蒲公英总黄酮提取率的方差分析Tab.3 Variance analysis of extraction rate of total flavonoids from Taraxacum

运用Design-expert 8.0.6.1软件分别绘制各因素的3D响应面曲面图（图2）。直观地反映各优化因素对蒲公英总黄酮提取率的影响，形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[18]。乙醇体积分数对蒲公英总黄酮提取率影响最大，表现为相关曲面斜率大（图2a、2b、2c）。响应面图投影面为等高线图，等高线的形状可反映出各因素交互作用的强弱[19]，各试验因子之间均存在较强的交互作用，其等高线呈现明显的椭圆形状，与上述回归方程的方差分析结果相一致（图2）。模型预测最佳提取工艺：乙醇体积分数61.58%、料液比1∶37.72 g/mL、浸泡时间46 min、回流时间2.52 h，总黄酮的理论得率为7.944%。

2.3 验证性实验

结合试验的可行性，将预测参数调整为乙醇体积分数61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡时间46 min、回流时间2.5 h，平行提取3次，蒲公英总黄酮提取率分别为7.96%、7.93%、8.01%，平均值为7.97%（RSD=50.73%），基本与预测值一致。重复性实验证明，该工艺具有不错的稳定性，与预测一致。

2.4 MIC和MBC值的测定结果

蒲公英总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的MIC值分别为8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL（表4）。从MIC值可以看出，蒲公英总黄酮提取物对金黄葡糖球菌和白色念珠菌具有较好的抑制活性，有很高的应用价值，对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等其他6种菌也有一定的抑制活性，但逊色于前二者，表现出明显耐受性个体差异。

图2 两因素交互作用对总黄酮得率的响应面Fig.2 Response surface of interaction of two factors on yield of total flavonoids

表4 蒲公英总黄酮提取物对8种供试菌种MIC和MBC值Tab.4 Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration of 8 tested strains against total flavonoid extract of Taraxacum

3 结论

该工艺在乙醇回流提取的基础上增加浸泡环节，通过单因素和响应面方法优化蒲公英总黄酮的提取工艺，考察乙醇体积分数（A）、料液比（B）、浸泡时间（C）、回流时间（D）对提取工艺的影响。通过Box-Behnken试验，得到最佳工艺：乙醇体积分数61.6%、料液比1∶38 g/mL、浸泡时间46 min、回流时间2.5 h，蒲公英总黄酮平均提取率为7.97%（RSD=50.73%）。

抑菌实验表明：蒲公英总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌8种测试菌均有抑制活性，MIC值分别为8、32、64、64、128、64、128、8 mg/mL。