SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离拟南芥叶片实验教学的改进

王琳 刘杰 黄金林 潘志明

摘要：目的：改进拟南芥叶片的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离拟南芥叶片。主要比较和分析了两种样品溶解液和两种染色方法对实验的影响。改进的样品溶解液可防止样品的损失，节约样品和试剂；改进的染色方法操作时间短，灵敏度高，分离条带多且清晰。结论：改进的实验方法可以得到更为灵敏、清晰的实验结果，同时节约了实验经费和实验时间，减少了实验准备人员的工作量，更好地适应和促进了实验教学工作。

关键词：实验教学；改进；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；叶片

中图分类号：Q503 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2019）30-0266-02

目前，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳已成为蛋白质分析过程中所普遍采用的方法[1-3]。它具有结果直观、分辨率较高、信息量大，技术成熟等优点，因此，此实验也成为本科生生物化学实验中的基础性实验，是生物化学实验教学的重要内容。

一、方法

1.拟南芥叶片蛋白提取。用液氮研磨适量拟南芥叶片，加入蛋白提取缓冲液，涡旋震荡15秒后，4℃，6000g离心30分钟，收集上清，并用丙酮沉淀，即为叶片蛋白。将蛋白质样品1mg左右，按1.0—1.5 g/L溶液比例，向样品加入“样品溶解液”溶解后，在100℃沸水浴中保温2—3分钟，取出冷至室温。

2.电泳。先制备分离胶，再制备浓缩胶，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内。凝胶聚合后，小心拔去“梳子”。将电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器在样品凹槽内加样，加样体积为10μl。将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在15—20 mA，待样品进入分离胶后，改为30—50mA。待蓝色染料迁移至下端约1—1.5cm时，停止电泳。将凝胶片取出，滑入一培养皿内，加固定液固定后，加入染色液，染色完毕，加入脱色液，直至背景清晰。

3.实验方法的改进。（1）样品溶解液的改进。原蛋白质样品溶解液：SDS 100 mg，巯基乙醇0.1 ml，甘油0.7 ml，溴酚蓝2 mg，Tris-HCl缓冲溶液2ml，加蒸馏水至总体积10 ml。改进的蛋白质样品溶解液：SDS 100 mg，巯基乙醇0.1 ml，甘油1.0 ml，溴酚蓝2 mg，Tris-HCl缓沖溶液2 ml，加蒸馏水至总体积10 ml。（2）染色方法的改进。原染色方法：常规CBB R-250染色。将凝胶浸泡在固定液中3—4 h，然后在CBB R-250染色液（45%乙醇，10%乙酸，0.1%CBB R-250）中染色过夜，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液（无R-250的染色液）脱色，20min/次，至背景颜色浅淡，蛋白质条带清晰即可。改进的染色方法：蓝银染色。将凝胶浸泡于固定液中固定30min，以双蒸水洗4次，每次15min，然后在染色液（0.12% CBB G-250，10% 硫酸铵，10% 磷酸和20%甲醇）中染色3—4 h，用蒸馏水漂洗数次直至背景颜色浅淡，蛋白质条带清晰即可。

二、结果与分析

1.原样品溶解液配制方法与改进的样品溶解液配制方法的分离效果比较。由于原来的甘油浓度使样品沉积效果不好，因此增加了甘油的浓度。这样样品会尽可能多地进入凝胶。图1（a）为原溶解液法和原染色方法分离的拟南芥叶片PAGDE图谱，图1（b）为改进的溶解液法和改进的染色方法分离的拟南芥叶片PAGDE图谱。从图1中可以看出，原方法分离的蛋白条带显现较少，大多数低峰度蛋白条带无法显现（图1a）。改进的方法分离蛋白的条带较多，背景清晰，图1（a）中清晰的蛋白条带在图1（b）中进一步加深，有些图1（a）中检测不到的条带在图1（b）中检测到了（图1b），因此，改进的方法灵敏度更高，更节约时间，分离效果更好，更适合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离拟南芥叶片的实验教学。

三、讨论

样品裂解液既要尽可能充分地溶解蛋白样品，也要保证溶解的蛋白样品能尽可能进入到电泳体系中。甘油可以协助沉淀蛋白质。改进后的样品溶解液提高了甘油的比例，这样使得溶解的蛋白样品能尽可能全部进入到电泳体系中，从而间接增加了蛋白样品的上样量，节约了蛋白样品的用量，而且还同时可以得到较好的蛋白分离效果。染色方法是影响实验分离效果的一个关键的环节，它影响了实验的显像结果。目前大多数实验用的常规的染色方法仍是考染。迄今还未见有将经典考染和蓝银染色这两种方法用于常规实验比较的报道。通过本实验的研究发现蓝银染色的灵敏度要高于经典考染（图1）。电泳中常规的染脱色法以考马斯蓝、乙酸和水作为染色和脱色剂，所需时间冗长，不便于凝胶成像。改进的染色法中甲醇可以更好地把蛋白质固定在凝胶中。磷酸既可以维持染液的酸度，又有利于蛋白质与考马斯亮蓝的结合。硫酸铵使得蛋白染色灵敏度得以提高。因此改进的染色方法更有利于获得条带数量多、背景清楚、灵敏度高的凝胶图像。这些实验方法的改进对实验教学工作产生了很大的影响。如：（1）可以节约实验成本。改进的实验方法比原实验方法可以更好地防止样品的损失，从而节约了样品。改进的实验方法比原实验方法少用3%的甘油，节约了试剂。这些都更好地节约了实验成本。（2）可以节约实验时间。原染色方法染色时间较长（需过夜），脱色时间也较长。这不仅浪费试剂，而且也造成时间的浪费。改进的染色方法染色时间较短（3—4h），脱色时间也较短。所用试剂较少（脱色液只用蒸馏水），这既节约试剂，减少了试剂的污染，而且也节约了宝贵的时间，能让学生在规定的实验时间内得到理想的结果。（3）减少了实验准备人员的工作量。如今实验准备人员紧缺，这更大地发挥了实验工作人员的价值。

四、结论

本实验方法弥补了SDS聚丙烯酰胺凝胶分离拟南芥叶片蛋白传统方法的一些不足，如用改进的样品溶解液代替原溶解液；用改进的蓝银染色方法代替原考马斯亮蓝染色方法。这些对实验的改进得到了更为灵敏、清晰的实验结果，同时节约了实验经费和实验时间，能让学生在规定的实验时间内得到理想的结果。同时也减少了试剂污染和实验准备人员的工作量，更好地适应和促进实验教学工作，也有利于其他老师从中得到启发。

参考文献：

[1]崔雪莹，相美容，武皓.薏苡仁蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析[J].山东中医杂志，2017，（2）：155-157.

[2]王芳，李晓静，周延清，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大豆SRAP标记[J].中州大学学报，2014，（6）：125-128.

[3]张延红，高素芳，陈红刚，等.甘草种子蛋白质提取及SDS-PAGE电泳技术研究[J].种子，2016，35（2）：21-24.