活血益气方促缺氧人脐静脉内皮细胞迁移及其相关调控基因mRNA表达的拆方研究

2019-08-12 10:59
中西医结合心脑血管病杂志 2019年13期
关键词:益气内皮细胞活血

活血益气方是基于冠心病气虚血瘀病机构建的临床经验方,前期多项动物实验研究证实本方可激活血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,促进心肌梗死后血管新生,增加心肌侧支循环的建立,具有提高后心力衰竭心脏功能和逆转左室重构改善心肌缺血的作用[1-4]。从细胞机制来讲,血管内皮细胞是缺血性心脏病中血管新生的主要靶细胞,内皮细胞的增殖及其与基底膜解离并穿过血管壁移行到血管周围间隙,进而黏附、芽生,形成管腔结构等一系列过程是血管新生的关键步骤[5]。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是研究血管生成的主要细胞,通过检测HUVEC的增殖及迁移能力可用于评估血管生成的能力。前期研究表明,活血益气方及其拆方可明显促进缺氧后HUVEC的增殖并抑制其凋亡,作用机制可能与调节PKC/Ras/ Raf-1信号通路和减少氧化应激损伤有关[6]。然而,活血益气方及其拆方对内皮细胞增殖之后其他重要环节的调控作用尚未可知。为进一步明确活血益气方及其拆方促血管新生的细胞机制及配伍规律,本研究通过建立HUVEC缺氧模型模拟心肌缺血缺氧的病理环境,观察活血益气方及其拆方药物血清对缺氧HUVEC迁移能力的影响,并通过研究其对细胞迁移粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和应激活化蛋白激酶-2(mitogen-activated protein kinases-2,p38)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的作用,进一步探索活血益气方促进内皮细胞迁移的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物 原代人脐静脉内皮细胞(Scien Cell研究实验室,批号:15482)。成年健康雄性SD大鼠32只,7周龄,体重230~250 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室SPF级屏障动物房,动物许可证号:SCXK(京)2012-0001。

1.2 药物及试剂 活血益气方:黄芪60 g,党参60 g,丹参10 g,川芎10 g,赤芍10 g,红花10 g;活血方:丹参10 g,川芎10 g,赤芍10 g,红花10 g;益气方:黄芪60 g,党参60 g。所有药物均采用免煎颗粒,由北京康仁堂医药有限公司提供,常温干燥保存。ECM培养基、胰酶/EDTA消化液、胰酶中和液、牛源纤维粘连蛋白(Scien Cell研究实验室,批号分别为21430,18898,18952,17573);磷酸盐缓冲液(PBS)、4%多聚甲醛、1%结晶紫染色液(Solarbio科技有限公司,批号分别为20170221,20160425,20160811);Trizol试剂(Ambion公司,批号101004);反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,批号00337818);SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems,批号1610048);Transwell Insert (Merck-millipore,批号M151315)。

1.3 主要仪器 EQR/GL-41A超净工作台(ESCO公司),IMT-2倒置相差显微镜(日本Olympus公司),MCO-20AIC CO2细胞培养箱(SANYO公司),MiniGalaxy A三气培养箱(RS biotech公司),GeneAmp PCR system 9700基因扩增仪(美国AB 公司),Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国安捷伦科技公司),Gene Quant紫外分光光度计(Pharmacia Biotech公司)。

1.4 药物血清制备 将32只大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、活血益气方组、活血方组和益气方组,每组8只。参照文献[2],按照活血益气方组16.086 g/(kg·d),活血方组4.016 4 g/(kg·d),益气方组12.049 2 g/(kg·d)的剂量,5 mL/kg体重给予大鼠相应药物灌胃,正常对照组灌服等量生理盐水,每天1次,连续7 d。采血前12 h禁食不禁水,末次给药后1 h,将大鼠按5 mL/kg体重腹腔注射7%水合氯醛进行麻醉。待大鼠完全麻醉后,备皮,无菌腹主动脉取血,室温静置2 h,3 000 r/min离心10 min,分离血清,合并同组血清,56 ℃灭活30 min,分装,-80 ℃冻存备用。

1.5 HUVEC缺氧模型的建立及分组给药 参照文献[6],取对数生长期的HUVEC均匀接种于纤维粘连蛋白(2 μg/cm2)预包被的细胞培养板中,常规培养24 h后,换用含0.5%胎牛血清的ECM培养基饥饿培养24 h。继续换用完全ECM培养基(5%胎牛血清、1%内皮细胞生长添加物),将细胞置于缺氧培养箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培养24 h,建立缺氧HUVEC细胞模型,另设相应的正常对照组细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将缺氧HUVEC分为缺氧组、活血益气方组、活血方组、益气方组。药物组分别换用含活血益气方、活血方、益气方药物血清的ECM培养基(10%相应药物血清、1%内皮细胞生长添加物),正常对照组和缺氧组换用含10%正常对照血清的ECM培养基干预24 h。

1.6 Transwell Insert检测细胞迁移 建立细胞缺氧模型后,0.25%胰酶消化收集细胞,采用基础ECM培养基制成单细胞悬液。将Transwell Insert置于24孔板中,下层小室中加入600 μL含10%相应药物血清的ECM培养基,将细胞按1×105个/孔均匀加入上层小室,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h。取出上层小室,用棉签轻拭去小室内的细胞,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定20 min,结晶紫染色15 min,倒置显微镜下观察微孔滤膜下表面的细胞,每组设3个复孔,每个样本随机选择5个高倍镜视野(×200)进行细胞计数。

1.7 实时荧光定量PCR法检测细胞FAK、p38、MAP激酶活化蛋白激酶(MAPKAPK)、热休克蛋白27(HSP27)mRNA表达 将细胞按1×105/孔均匀接种于6孔板中,建立细胞缺氧模型,药物干预24 h后,收集细胞。采用Trizol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定吸光度A260/A280,计算其浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明书将所提取的RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测,每组设5个复孔。循环参数为预变性95 ℃、10 min,变性95 ℃、1 min,退火55 ℃、30 s,延伸72 ℃、20 s,共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照。目的基因引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成,目的基因引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

2 结 果

2.1 活血益气方及其拆方对缺氧HUVEC迁移的影响 与正常对照组比较,缺氧组细胞迁移数显著减少(P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组及益气方组细胞迁移数均显著增加(P<0.05或P<0.01)。活血益气方组细胞迁移数高于活血方组,差异有统计学意义(P<0.05);益气活血方组高于益气方组,但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图1。

组别只数 细胞迁移数正常对照组3236.867±5.015缺氧组3118.333±5.0991)活血益气方组3149.733±3.5801)3)活血方组3133.400±3.3001)2)4)益气方组3143.867±5.4971)3)

与正常对照组比较,1)P<0.01;与缺氧组比较,2)P<0.05,3)P<0.01;与活血益气方组比较,4)P<0.05

2.2 活血益气方及其拆方对FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表达的影响 与正常对照组比较,缺氧组细胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA表达均显著下调(P<0.01)。与缺氧组比较,活血益气方组、活血方组、益气方组细胞FAK、p38 mRNA表达水平显著上升(P<0.05或P<0.01);活血益气方组、益气方组细胞MAPKAPK mRNA表达水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),活血方组细胞MAPKAPKmRNA表达上升,但差异无统计学意义(P>0.05);活血益气方组HSP27 mRNA表达水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05),活血方组、益气方组HSP27 mRNA表达水平上升,但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

3 讨 论

活血益气方由黄芪、党参、丹参、川芎、赤芍、红花等药物组成,方中黄芪、党参相须相使,达补气培元的功效,使五脏得养,心气得充,配以丹参、川芎等药物活血养血,则心气得以血气之濡养,可理气活血、化瘀止痛,在临床应用中得到显著疗效。此外,大量基础研究表明,活血益气方可显著增加大鼠心肌梗死边缘区微血管密度,促进血管新生[1-4]。

血管内皮细胞透过血管壁发生迁移是新血管形成的关键环节,当内皮细胞移行至血管周围间隙时,可通过进一步的黏附与增殖形成血管芽,再经过周围细胞的包绕逐渐形成新的血管。本实验结果显示,缺氧后HUVEC迁移能力显著受到抑制,活血益气方及其拆方可明显改善缺氧对HUVEC迁移的损伤。前期研究发现活血益气方及其拆方还可促进缺氧HUVEC增殖并抑制其凋亡[6],显示出活血益气方显著的促血管新生效用,并提示其作用机制可能与靶向内皮细胞调控相关信号通路促进缺氧后内皮细胞增殖与迁移并减少其凋亡有关。多项研究表明,活血益气方中的主药黄芪、丹参、川芎、赤芍以及丹参配伍黄芪、川芎配伍黄芪等。对血管内皮细胞的迁移能力均具有明显促进作用[7-9]。

A、B、C分别为正常对照组倒置显微镜下40倍、100倍、200倍视野;D、E、F分别为缺氧组倒置显微镜下40倍、100倍、200倍视野;G、H、I分别为活血益气方组倒置显微镜下40倍、100倍、200倍视野;J、K、L分别为活血方组倒置显微镜下40倍、100倍、200倍视野;M、N、O分别为益气方组倒置显微镜下40倍、100倍、200倍视野

图1各组HUVEC迁移情况

表3 各组对缺氧HUVEC FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表达水平的影响(±s)

与正常对照组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与缺氧组比较,3)P<0.05,4)P<0.01

细胞迁移是一种动态的、多步骤的生理病理过程,包括细胞前缘突出,与细胞外基质形成粘着斑,局灶性粘连的周转,继而产生牵引力等[10]。FAK是一种细胞质酪氨酸激酶,可加强局灶性粘连周转过程。在VEGF介导的信号通路中,活化的FAK与Src家族激酶形成复合物,通过磷酸化其他蛋白质启动多个下游信号传导途径,以介导各种细胞的迁移[11],是细胞运动和细胞存活的正向调节因子[12-13]。FAK是VEGFR-2和整合素αvβ3之间的融合信号点,它控制了在内皮细胞迁移过程中调节肌动蛋白聚合所必需的局灶性粘连的组装/拆卸[14]。FAK基因敲除小鼠引起胚胎早期致死性与广泛的心血管缺陷[15]。

此外,p38-MAPK信号通路是VEGF诱导内皮细胞迁移的另一重要靶向途径。VEGF可通过刺激p38,进而导致MAP激酶活化蛋白激酶-2/3(mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2/3,MAPKAPK-2/3)和丝状肌动蛋白聚合调节分子及HSP27的激活,将VEGF信号传递到微丝,诱导调节细胞迁移的肌动蛋白细胞骨架的重排,最终产生内皮细胞移行[16]。FAK介导的局灶性粘连周转以及p38介导的肌动蛋白聚合在促进形成应激纤维中具有互补作用,这些结构产生牵引细胞所需的收缩力,从而使内皮细胞定向迁移[14]。

本研究发现,活血益气方及其拆方可不同程度地上调缺氧抑制的FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA的表达水平,提示活血益气方及其拆方可改善缺氧导致的FAK及p38-MAPK信号通路活性的降低,促进细胞骨架重组,提高HUVEC的移行能力进而发挥促血管新生效应。其中活血益气方促迁移效应最强,益气方优于活血方,提示在促进迁移的作用方面活血方和益气方协同配伍,而益气药物发挥主要作用。前期试验表明,活血益气方可以促进HUVEC中VEGF诱导的基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9(参与降解细胞外基质)[17]、一氧化氮(nitric oxide,NO)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS,参与VEGF介导的血管渗透性增加)[17]的产生,提示活血益气方能增加细胞外基质成分和基底膜的降解,通过促进eNOS分泌催化生成NO或直接促进NO的分泌,提高血管通透性,为内皮细胞向血管周围间隙移行提供有利环境,这与本研究结果相一致。

综上所述,活血益气方及其拆方可提高缺氧后HUVEC的迁移能力,这一作用可能是通过调节FAK及p38-MAPK信号通路来实现的。结合前期研究基础,推测活血益气方及其拆方可对血管新生中细胞机制的多个环节进行多靶点的调控,这是其促进缺血心肌血管新生,改善缺血性心脏病的关键途径之一。

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