电感耦合等离子体质谱测定尿铜不确定度评定

汤燕燕 陈金发

铜是人体必需元素，血液中的铜大约有40%与组氨酸或清蛋白结合，其余均与铜蓝蛋白结合[1]。临床上，尿铜作为诊断肝豆状核变性的重要参考指标，越来越多被应用于研究[2-5]。检测领域普遍认为完整的测量结果应包括测量不确定度。医学实验室测量不确定评定方法主要有“自上而下法”和“自下而上法”，前者被广泛应用于医学实验室测量不确定度评定[6-8]。当“自上而下法”评定的测量不确定度达不到目标不确定度时，可用“自下而上法”识別不确定度的各种来源，通过改进产生主要影响因素的实验过程，从而降低项目的测量不确定度。目前在卫生相关领域，自下而上法评定不确定度的文章已有报道[9-10]。文章依据《测量不确定度评定和表示》[11]、《生物样本测量不确定度评定与表示应用指南》[12]，采用自下而上法对电感耦合等离子体质谱测定尿铜的过程产生的不确定度进行评定，为改进测量过程、降低测量不确定度提供一定的参考价值。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

涡旋振荡器为广州仪科实验室技术有限公司生产，型号为MS3 basic S25；微控数显电热板为莱伯泰科有限公司生产，型号为EH45A Plus；电子天平为英国艾德姆公司生产，型号为PWC184；电感耦合等离子体质谱仪为美国PerkinElmer公司生产，型号为NexION 350X；一体化超纯水系统为美国Merck MILLIPORE公司生产，型号为ELIX Essential＋SynergyUV；多元素混合标准溶液由美国PerkinElmer公司生产；优级纯浓硝酸为国药集团化学试剂有限公司生产；整个实验过程所有用水均由一体化超纯水系统制得。

1.2 实验步骤

尿样来自健康体检的成人尿液，并按下述步骤对尿样进行前处理：首先使用振荡器对尿样进行均匀振荡，然后取30 mL的PFA溶样罐，先后加入2.5 mL移液管吸取的尿及5 mL优级纯浓硝酸，轻加盖，置于微控数显电热板，保持在80 ℃半小时后，将瓶盖旋紧，待温度上升至120 ℃后不再升温，继续消解至透明澄清。接着设置温度为80 ℃，开盖赶酸直至溶液剩余体积小于1 mL，随后自然冷却至室温，用超纯水作为溶剂定量至50 g，以0.22 µm滤膜过滤，用电感耦合等离子体质谱仪采用外标法对定容后的消解试液进行测量。空白试验、平行试验以及加标试验按上述相同步骤同时进行。

1.3 系列标准工作溶液配制

用移液器准确移取含铜浓度为100 µg/mL的多元素混合标准储备溶液10 µL,加入到EP管中，加入990 µL超纯水，用涡旋振荡器混合均匀，得到含铜浓度为1 µg/mL的多元素混合工作溶液。各浓度标准工作溶液的配制步骤为用适当量程的移液器分别移取对应体积含铜浓度为1 µg/mL的多元素混合工作溶液，以超纯水作为溶剂，在天平上定量至10 g，涡旋振荡器混匀。配制浓度、使用移液器量程和移取体积见于表1。

2 结果

2.1 项目不确定度的来源分析评定

2.1.1 建立数学模型

式中：X为尿样中铜元素含量（单位：ng/mL）；ci为消解试样溶液扣除空白对照后铜的质量浓度（单位：ng/g）；M为消解液的定容质量（单位：g）；v为试验尿样体积（单位：mL）；frep为重复测量的影响因子。

2.1.2 项目各不确定度分量评定

根据上述构建的数学模型，尿样中铜元素含量测定的不确定度来源包括尿样体积移取产生的不确定度u（v）；消解试液中铜元素浓度测定过程产生的不确定度u（c）；电子天平定量消解液产生的不确定度u（M）；重复多次测量所产生的不确定度u（rep）。

2.2 项目各不确定度分量计算

2.2.1 试验尿样体积移取产生的不确定度u（v）

2.2.2 消解试液中铜元素浓度测定过程产生的不确定度u（c）

表1 各浓度标准工作溶液配制过程移液器产生的不确定度

表2 铜元素重复测定结果

表3 各不确定度分量的相对不确定度

2.2.2.4 系列标准工作溶液线性拟合产生的不确定度u4（c）采用质量浓度不同的5个标准溶液进行线性拟合，每个浓度的标准溶液测1次，分别得到对应的响应值。为得到铜元素的标准工作曲线，以铜元素的质量浓度为横坐标，每个浓度对应测得的响应值为纵坐标，采用最小二乘法进行拟合，得到线性方程为：y=512.7x-233.54,该拟合曲线的线性相关系数R2大于0.999 6。3个平行消解试液测得的响应值（扣除空白对照后）分别为y1=4 089.7，y2=4 112.7，y3=4 084.8，代入方程计算得到3个消解液的浓度分别为，8.43 ng/g，8.48 ng/g，8.32 ng/g，平均值

其标准不确定度按如下公式计算：

式中：s为标准工作曲线回归偏差；a为拟合曲线的斜率；；P为平行测量的次数（本实验P=3）；N为拟合曲线数据点数（本实验N=5）；c0为消解液的质量浓度；为拟合曲线系列标准溶液中铜元素的平均质量浓度；ci为拟合曲线第 个标准溶液的浓度；yi为第i个标准溶液测得的响应值； b为拟合曲线的截距。

2.2.4 重复多次测量所产生的不确定度u（rep） 在相同条件下对试液中的铜元素浓度进行7次测量，数据结果如表2。

2.3 项目不确定度分量的合成

2.4 扩展不确定度及结果

3 讨论

文章利用电感耦合等离子体质谱，采用外标法，测定了人尿液中的铜元素的含量。同时采用自下而上的不确定度评定方法，对该测量过程的不确定度来源进行了分析，并计算了模型下各个不确定度分量和合成不确定度。从表3可以看出，在所建立的数学模型中，合成不确定度的影响因素依次为消解试液中铜元素浓度测定过程产生的不确定度、重复多次测量所产生的不确定度、试验尿样体积移取产生的不确定度、电子天平定量消解液产生的不确定度。试样中铜元素浓度的不确定度主要由标准储备液本身、标准储备液稀释过程、系列标准溶液配制过程、系列标准工作溶液曲线线性拟合过程产生的。它们产生的影响大小依次为系列标准工作溶液配制过程、多元素混合标准储备液稀释过程、系列标准溶液线性拟合过程、标准储备液本身。从文中可以发现，采用天平作为定容质量工具，产生的不确定度较小，而移液器产生的不确定度较大。因此采用天平定量可提高实验效率；同时，实验过程中应选用合适量程规格的移液器，且所使用的移液器应该定时检定计量。本实验同时表明了拟合曲线的各标准点浓度选择会影响不确定度，应尽可能让测量点落在线性的中间位置，仪器的灵敏度也会影响不确定度，应对仪器做好期间核查，以确保灵敏度在正常范围内。

综上所述，采用电感耦合等离子体质谱测定尿中铜元素含量的过程中，要使用纯度足够的标准试剂，选择检定合格且量程适合的量器具，并设计合理的工作曲线范围，同时对所涉及的仪器、试剂、环境质量进行严格管控，从而减小测量的不确定度，确保实验的准确性。通过对测量过程进行不确定度评定和分析，可以让实验者更好的把握和控制实验的每个环节，提高实验效率，降低实验误差。