利用废纸产纤维素酶复合菌系的筛选及性质研究

曹燕篆 王小娟 袁旭峰

摘要：为了获得1组能够高效分解废纸并产胞外纤维素酶的复合菌系，采用外淘汰法，在常温条件下以土壤及枯枝落叶为菌源，以废打印纸为唯一碳源，筛选得到1组复合菌系PSD。结果表明，该复合菌系能够在6 d内分解纸总质量的71%，其中纤维素降解率为72%，半纤维素降解率为48%。此外，羧甲基纤维素酶活性在分解3 d时达到最高值 3.26 U/mL，半纤维素酶活性在分解4 d时达到最高值6.37 U/mL。当培养温度在25～35 ℃，培养基pH值在 6.0～8.0，培养基为Hutchinson时，复合菌系具有较好的纸分解效果和产酶活性。利用16S及26S rRNA克隆技术分析微生物组成结果表明，该复合菌系由细菌和真菌组成，其中细菌主要包括厚壁菌门、变形菌门及拟杆菌门，真菌主要包括波氏假性霉样菌（Pseudallescheria boydii）。由研究结果可知，得到的复合菌系PSD能够有效分解废纸并同时分泌纤维素酶，对打印纸废弃物的分解及资源利用具有一定的应用意义。

关键词：复合菌系;废纸分解;纤维素酶;微生物组成

中图分类号： S182;X705 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0237-05

随着现代制造技术的发展，一次性纸张已经成为廉价商品，过去40年内，全球紙的消费量增长了400%，每年产生的废纸量达4亿t以上。废纸作为最普遍的回收材料之一，理论上可循环使用6～7次，但是纸经多次回用后纤维流失率大，且纤维短，利用效率低，因此，全球纸张的平均回收水平只有2.4次[1]。不合理处理无法循环利用的废纸（如填埋或焚烧），会造成温室气体的排放、垃圾渗滤液污染等环境问题[2]。因此，开发多种资源化利用方式，对废纸进行充分利用，不仅可以节约大量植物木质纤维原料，同时可以减少固体废弃物的排放及对环境的污染。

废纸主要由纤维素（40%～80%）、半纤维素（5%～15%）及少量的木质素组成[3]。近年来的研究发现，利用多种技术可将废纸转化为乙醇、甲烷、氢等能源物质[4-6]，为了提高转化率，往往需要物理、化学或酶预处理，从而在一定程度上增加了经济成本，或对环境造成了一定的污染。其中利用酶转化废纸材料具有很多优势，如底物特异性高、能源消费低、环境污染水平低等。然而，昂贵的成本成为纤维素酶制剂应用的瓶颈。近年来，利用农业或者工业废弃物通过液体或固体发酵的方式生产纤维素酶成为研究热点，例如以水稻秸秆、玉米穗、象草、甘蔗渣及生活污水等为底物[7-12]。在纤维素酶的相关研究中，由于真菌能够分泌大量纤维素酶及半纤维素酶，并且会将其分泌到细胞外至培养基中，易于分离纯化，成为重要的研究对象。但是，用真菌单独分解木质纤维素材料往往需要较长时间[13]。近年来的研究发现，复合菌系能够有效降解水稻秸秆、玉米秸秆、柳枝稷及滤纸等木质纤维素材料，但是以液体微好氧条件培养的复合菌系胞外酶活性较低[14-15]。因此，在好氧条件下筛选1组由真菌及细菌共同组成，且能够高效分解废纸并分泌纤维素酶的复合菌系，对废纸的资源化利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 复合菌系的筛选

复合菌系筛选用Mandels固体培养基，配方如下：1.4 g（NH4）2SO4，2.5 g蛋白胨，0.3 g MgSO4·7H2O，2 g CaCO3，2 g KH2PO4，5 mg FeSO4·7H2O，1.6 mg MnSO4，1.7 mg ZnCl2，1.7 mg CoCl2，12 g琼脂，1 L去离子水，调节pH值至7.0。将培养基于121 ℃灭菌30 min后倒平板待用。

菌源于2010年取自北京植物园的土壤、枯枝落叶，加入50 mL灭菌去离子水，于200 r/min振荡20 min，吸取1 mL至上述培养基平板上，将（0.5±0.1） g灭菌的废打印纸盖在培养基表面作为唯一碳源，于30 ℃静置培养。待废纸分解后，将残余部分刮下并置于50 mL灭菌离心管中，加入30 mL灭菌去离子水，混匀后吸取0.5 mL进行转接。淘汰废纸分解效率低的菌系，将分解能力强的复合菌系每隔4～6 d转接1次，直至功能稳定。向培养3 d的复合菌系与分解剩余的纸中加入25%甘油，于-80 ℃保存。

1.2 降解率

通过测定纸的总质量减少量及木质纤维素成分质量减少量，分析复合菌系对废纸的分解能力。将培养3 d的复合菌系通过“1.1”节的方法制备菌液并接种到21个新的培养基上，加入灭菌的废纸培养6 d，从0 d开始每天取样，每次3个重复，于60 ℃烘干48 h后称质量分析纸的分解情况。将残余的纸烘干后剪至5 mm×5 mm大小，装入F57专用袋（Model F57，ANKOM Technology，USA）中，根据ANKOM220型纤维分析仪说明书测定纤维素、半纤维素含量。

1.3 粗酶液的制备及酶活性的测定

在培养期间，收集分解残余的纸制备粗酶液。从平板上刮下分解剩余的纸，加入30 mL灭菌去离子水充分混匀，浸提底物表面的胞外酶，于8 000 r/min离心10 min后所得上清液即为制备好的粗酶液。羧甲基纤维素酶活性及木聚糖酶活性的测定方法参照文献[16]。

1.4 最佳产酶条件

纤维素酶的产生会受培养基pH值、发酵温度及养分等的影响[17]，为了确定复合菌系分解废纸过程中的最佳产酶条件，设置不同培养温度（25～45 ℃）、培养基pH值（5.0～8.0）及培养基种类（Mandels、Hutchinson、Dubos、PCS及PA）。不同培养基养分组成如下。（1）Hutchinson：1 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeCl3，0.1 g/L CaCl2·6H2O，0.1 g/L NaCl，2.5 g/L NaNO3。（2）Dubos：1 g/L K2HPO4，1 g/L NaNO3，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.05 g/L Fe2（SO4）·H2O。（3）PCS：5 g/L蛋白胨，1 g/L酵母粉，2 g/L CaCO3，5 g/L NaCl。（4）PA培养基：在1 L去离子水中加入200 g马铃薯条，煮沸5 min，用纱布过滤后加入去离子水将总体积补足至1 L。上述培养基中均加入12 g/L琼脂，调节pH值至7.0，于121 ℃灭菌30 min。在上述不同条件下，复合菌系于接种后4 d取样，测定废纸的减质量及粗酶液酶活性。

1.5 复合菌系微生物组成分析

复合菌系基因组DNA的提取采用苯酚-三氯甲烷抽提法，将提取后的DNA作为模板进行PCR扩增。DGGE（变性梯度凝胶电泳）及克隆方法参照文献[15]。测序结果使用Lasergene软件（DNAStar，Madison，Wisconsin，USA）进行分析，序列相似性比对通过BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），用MEGA 5.1软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 复合菌系PSD对废打印纸的分解能力

经过连续传代30次以上，筛选到1组能够有效分解废纸并产纤维素酶的复合菌系PSD。由图1接种复合菌系后废纸的总质量降幅及木质纤维素质量降幅可以看出，培养3 d后，纸的总质量减少了24.9%，其中纤维素、半纤维素分别减少了38.1%、29.9%。分解6 d后，复合菌系PSD对废纸的分解率达到70.6%，其中纤维素减少了71.7%，半纤维素减少了48.2%。从图1还可以看出，培养3～6 d期间废纸的分解速率高于培养0～3 d的，并且复合菌系对废纸中纤维素成分的分解率高于半纤维素。

2.2 酶活性的变化

從图2可以看出，羧甲基纤维素酶、木聚糖酶活性在接种复合菌系2 d后快速增加，羧甲基纤维素酶活性在接种复合菌系3 d后达到最高值，为3.26 U/mL，木聚糖酶活在接种复合菌系4 d后达到最高值，为6.37 U/mL。结合图1中复合菌系对废纸降解率的影响，可见分解2 d后酶活性的快速提高增强了复合菌系对废纸的分解能力，此外复合菌系PSD能够有效分解废纸并以废纸为底物分泌活性较高的纤维素酶。崔宗均等以堆肥为菌源，筛选到1组能够高效分解天然木质纤维素的复合菌系MC1，但是其胞外酶活性很低[18]。另外，复合菌系XDC-2虽然能够分泌高活性的胞外木聚糖酶，但胞外羧甲基纤维素酶活性却很低，只有0.108 U/mL[19]。Richa等从土壤中分离出一些能够有效分解纸的真菌，但有关纸的分解情况及产酶情况并没有相关报道[20]。

2.3 产酶条件的优化

在不同培养条件下，接种复合菌系PSD 4 d后纸的分解率及产酶活性见图3。可以看出，当培养温度为25～35 ℃时，废纸的分解率及粗酶液的酶活性都较高，其中30 ℃时的分解率最高，为36.1%，在25 ℃条件下，复合菌系产酶的酶活性最高。但是当温度≥40 ℃时，废纸的分解率及酶活性明显下降。由此可见，复合菌系在温度≤35 ℃时能有效降解废纸并产纤维素酶（图3-A）。当培养基pH值为6.0时，羧甲基纤维素酶活性、半纤维素酶活性都达到最高值。将其最高相对酶活性视为100%，当培养基pH值高于6.0时，羧甲基纤维素酶、半纤维素酶的相对酶活性分别高于73%、86%，废纸的总分解率大于45%，并且当培养基pH值为7.0时，分解率最高，为51.1%。但是当pH值小于6.0时，无论是废纸的降解率，还是复合菌系产纤维素酶的酶活性都明显降低。总体看出，pH值为6～8时，复合菌系有较好的纸分解效果和产酶活性（图3-B）。以Hutchinson为培养基废纸为唯一碳源时，复合菌系对废纸的降解率最高，为50.1%，并且羧甲基纤维素的酶活性最高。当培养基为Hutchinson、Mandels及Dubos时，废纸的降解率及酶活性明显高于PCS、PA培养基的降解率与酶活性（图3-C）。由此可见，Hutchinson为复合菌系分解及产酶的最佳培养基。

2.4 复合菌系PSD的微生物组成稳定性

为了确定复合菌系PSD的微生物组成已经稳定，利用PCR-DGGE技术对其总DNA进行分析。保存复合菌系继代培养过程中4 d后的培养物（第30、33、36、39代），提取总DNA并利用引物对357F-GC、517R及NL1-GC、LS2分别进行PCR扩增后用于DGGE分析。细菌、真菌的DGGE图谱见图4，可见继代培养过程中不同代真菌、细菌的群落结构相同，说明经过长期驯化培养，复合菌系PSD的菌群结构稳定，复合菌系在分解木质纤维素过程中群落结构的稳定性能够保证其功能的稳定性。

2.5 复合菌系PSD的微生物组成

利用克隆技术，分析复合菌系PSD的微生物组成，其16S rDNA、26S rDNA系统发育树分别见图5、图6。本研究共获得200个细菌克隆子，测序分析结果表明，主要为厚壁菌门（31.1%）、变形菌门（24.1%）及拟杆菌门（44.6%），其中厚壁菌门主要包括Sedimentibacter、柯恩氏菌（Cohnella）及泰氏菌属（Tissierella）。克隆子B74与Sedimentibacter sp. enrichment culture clone MB2_218有96%的相似性，有报道称，该菌对1，2，4-三氯二苯并-对-二英具有还原脱氯的作用[21]。克隆子B102、B160与Cohnella sp. FCN3-3（HQ704069）具有98%的相似性，该菌是1株从牛粪中分离并具有纤维素分解能力的细菌[22]。变形菌门主要包括假单胞菌（Pseudomonas）、不粘柄菌属（Asticcacaulis）及红杆菌属（Rhodobacter），其中克隆子B35与Pseudomonas stutzeris（施氏假单胞菌） train S1（AY485995）具有99%的相似性，该菌是从土壤中分离得到的，具有降解氟氯氰菊酯的能力[23]。拟杆菌门主要包括哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）、Cf. Cytophaga、Dysgonomonas及Chitinophaga。其中克隆子B31与Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406（CP000383）具有91%的相似性，对该菌的基因组测序发现能够编码很多参与纤维素利用的基因[24]。另外，在复合菌系XDC-2的微生物组成中也检测到Pseudomonas stutzeri、Dysgonomonas的存在[19]。Wang等筛选到的1组能够高效降解木质素、芳香族化合物的复合菌系LDC中有Pseudomonas sp.、Cohnella的存在[25]。

對获得的180个真菌克隆子进行测序的结果表明，共有波氏假性霉样菌（Pseudallescheria boydii）、Filobasidium floriformes及轮枝菌（Verticillium sp.）3种真菌，其中80.7%的序列与Pseudallescheria boydii（AB363764）具有99%的相似性。据报道，该菌广泛存在于堆肥中，可有效降解有机物，同时还可利用碳氢化合物及挥发性烷烃类物质，如乙烷、丙烷、丁烷等[26-27]。另外，研究发现Pseudallescheria boydii可有效降解有毒物质2，3，7，8-四氯二苯并二英及多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs）[28-29]。12.5%的序列与Verticillium sp.（AY312607）具有99%的相似性，有研究发现，黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum）、黄萎病病菌（Verticillium dahliae）都能够分泌多种纤维素酶并能有效分解纤维素。Klosterman等对这2株真菌进行宏基因组测序，结果发现基因组中有很多编码果胶降解酶及碳水化合物活性酶的基因[30-31]。据笔者所知，本研究是第1次在复合菌系中检测到有Verticillium sp.的组成。因此可见，PSD是一组由细菌和真菌共同组成的复合菌系。

3 结论

本研究成功筛选到1组能够高效降解废纸，同时分泌胞外纤维素酶的复合菌系PSD。该复合菌系能够在6 d内分解纸总质量的71%，其中纤维素、半纤维素的降解率分别为72%、48%。在复合菌系分解废纸期间，胞外羧甲基纤维素酶活性在3 d时达到最高值，为3.26 U/mL，半纤维素酶活性在 4 d 时达到最高值，为6.37 U/mL。

16S rDNA、26S rDNA克隆文库结果表明，复合菌系由真菌、细菌组成，其中细菌Cohnella、Pseudomonas及Cytophaga hutchinsonii可能是功能菌，Pseudallescheria boydii是主要的真菌组成。

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