虎杖苷转化菌的筛选及所产酶的性质研究

2019-08-13 08:55:35 《江苏农业科学》 2019年1期

张玉千 周学 郑丹

摘要:利用专一性底物法,以虎杖水提液为初始培养基,经过初筛复筛获得转化菌。根据菌落形态特征对菌株进行初步鉴定,对转化菌产酶的酶学性质进行研究。结果表明,通过筛选得到1株特异性转化虎杖苷为白藜芦醇的菌株,经形态学鉴定为青霉菌。该菌产的酶最适pH值为5.0,最适温度为60 ℃;Fe2+、Na+和Ca2+对酶活力有激活作用;虎杖苷是该酶理想的水解作用底物。利用该菌产的酶液转化虎杖原料,虎杖苷的转化率最高可达到100%。

关键词:白藜芦醇;青霉菌;微生物转化;虎杖苷

中图分类号: S182 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2019)01-0264-04

虎杖是一种常用的中药原料,主要活性成分是虎杖苷(白藜芦醇苷)、白藜芦醇和蒽醌类化合物。其中,白藜芦醇活性较高,具有抗炎杀菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、保护心血管及免疫調节等活性[1-8]。白藜芦醇的制备方法有传统提取法、微生物转化法、微生物发酵法。传统提取法主要以蓼科、葡萄科、豆科植物为原料提取[9-10]。其中,蓼科植物虎杖中白藜芦醇的含量可达0.45%,虎杖苷的含量最高可达2.55%[11]。虎杖苷是白藜芦醇与β-D-葡萄糖结合形成的糖苷,水解该糖苷键可以将虎杖苷转化成白藜芦醇[12]。如果能将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇,理论上可使其含量提高3.3倍[13],可以大大增加虎杖的药用价值。

针对虎杖苷中β-D-葡萄糖苷键的水解方法有化学法和生物法。化学降解法工序复杂,成本高,分离纯化困难,且白藜芦醇光热稳定性差[14],所以对虎杖苷的化学降解方法研究得较少。生物转化法中,王辉以筛选出高活性β-葡萄糖苷酶为依据筛选出米曲霉,利用该菌摇瓶发酵46 h后,虎杖苷可以被完全转化为白藜芦醇[15]。田天丽筛选得到根霉 T-34,通过带渣固体发酵技术在最佳发酵条件下发酵24 h后虎杖苷的转化率可达98%[13]。冯薇等筛选出细菌转化虎杖苷,8 h转化率可达90%以上。微生物转化虎杖的本质是通过所产生的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷,利用商品酶或利用微生物制备的酶制剂可用于虎杖苷的转化。王辉利用米曲霉所产的β-葡萄糖苷酶粗酶液直接处理虎杖粗药材,12 h转化率达100%[15]。

陈蓉蓉等对多种商品酶进行了筛选,确定以β-葡萄糖苷酶的转化效果最好,转化率高达98%[16]。生物酶的转化工艺较稳定,做成固定化酶可重复利用,转化效率高,但酶的纯化较为困难,商品酶成本高,在工业中的应用受到限制。利用微生物产酶转化虎杖苷较为可行,而筛选出转化时间短、转化效率高的菌种尤为重要。本试验筛选得到1株转化菌,对转化菌所产的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究,并且用粗酶液直接转化虎杖原料粉末。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株:青霉菌。

初筛培养基(%):10%虎杖煮提液,MgSO4 0.05 g,NaNO3 0.5 g,FeSO4 0.001 g,KH2PO4 0.1 g,琼脂1.8 g,pH值自然。

复筛培养基:10%虎杖煮提液,pH值自然。

固体产酶培养基:麸皮、豆粕粉(碳氮比为6 ∶ 4)。

固体营养液:磷酸氢二钠1 g,硫酸铵2 g,硫酸镁0.1 g,加水定容至100 mL,固液比为1 ∶ 2。

材料:虎杖药材产自江苏省宝华山。白藜芦醇苷、白藜芦醇对照品的纯度为98%,购自西安华翠生物技术有限公司。甲醇(HPLC级)、乙醇、乙睛(HPLC级)、乙酸乙酯。

仪器:GNP-9080隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备公司);ES-315高压蒸汽灭菌锅(TOMY,Japan);Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司);HD-930型组合式全温摇床(江苏太仓市博莱特实验仪器厂);高速离心机Sigma 3k30(Sigma公司)。

1.2 菌种筛选与鉴定

1.2.1 虎杖苷转化菌的筛选 初筛:取虎杖粉末用无菌水冲洗,梯度稀释,按常规方法涂布,30 ℃培养2 d,挑选出长势良好的单菌落,保藏待用。复筛:将初筛菌种活化培养,制成孢子悬液,转接至复筛培养基,30 ℃、160 rpm培养,取样检测。

1.2.2 菌种鉴定 将筛选到的菌株接种到PDA培养基上,在不同时间观察菌落生长性状,待产孢后取菌丝制作临时玻片在透视显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子,并描述它们的形态特征;用透视显微镜观察菌丝的自然生长和分支状况。根据形态特征对菌株进行分类鉴定。

1.3 酶学性质研究

1.3.1 粗酶液的制备 将活化后的菌种斜面用无菌水制成孢子悬浮液,接种到发酵产酶培养基,28 ℃条件下静止培养48 h。取固体曲,用pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浸提,固液比为1 ∶ 10,将其用尼龙纱布过滤,4 500 rpm离心15 min,上清液即为酶液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶最适温度及稳定性 在不同温度下分别以1%水杨苷和0.05%虎杖苷为底物,按常规法测定酶活力,分别于50、55、60、65、70 ℃测定酶活力。酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h,测定酶活力。取酶液,放于 60 ℃ 水浴中,分别在2、4、6、8、10、12 h取样,检测酶活力。

1.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液,常规方法测定酶活力。此外,将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后,按常规法测定对应的酶活力。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 分别配制浓度为 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水杨苷、纤维二糖、京尼平苷溶液,再以它们为底物,按常规法测定对应的酶活力。

1.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂,在酶反应液中分别加入上述金属离子,使其终浓度为1.0 mmol/L,于60 ℃温30 min,按常规法测定酶活力,以不加金属离子的酶活力为100%。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法

水杨苷法测定β-葡萄糖苷酶活力:于0.2 mL水杨苷溶液中加入0.2 mL酶液,混匀后60 ℃反应10 min,加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂后沸水浴5 min,冷却后蒸馏水定容至10 mL,在540 nm下测定其吸光度。

酶活力单位定义:1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反应1 min,产生1 μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 虎杖苷转化菌的篩选

通过初筛得到11株长势较好的菌种,菌株编号及转化27 h虎杖苷转化率如图1所示。初筛获得的11株菌种中,仅有H4、H6和2-6号菌有转化效果,且在转化27 h后转化率都达到了最大。其中H6号菌的转化率最高,为98%,故选取H6号菌作为虎杖苷转化菌株。

2.2 转化菌的鉴定

通过观察,菌落为绿色,背面为黄色。显微镜下观察并记录菌种的显微形态。由图2可知,显微镜下菌丝无色透明,表面光滑,有隔膜,直径为4~5 μm,菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗,分生孢子梗分枝呈扫帚状。孢子梗上着生分生孢子链,分生孢子为椭圆形,两端稍细,长5~7 μm,宽 3~4 μm。根据以上菌落形态、菌丝形状、孢子的形状及大小,初步确定为青霉属。

2.3 酶学性质研究

2.3.1 β-葡萄糖苷酶最适温度 由图3-a和图3-b可知,随着反应温度的增加,酶活力先提高后降低,在60 ℃时酶活力最高。以水杨苷为底物和以虎杖苷为底物测得的酶活力变化趋势一致。以水杨苷为底物测定酶活力能准确地反映该酶对底物的转化能力。

2.3.2 酶的稳定性影响 酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h,按常规法测定对应的酶活力。取酶液,放于60 ℃水浴中保藏,分别在2、4、6、8、10、12 h取样,常规方法检测酶活力。由图4可知,β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保温12 h后基本不失活,在60 ℃保温12 h后酶活力有损失,60 ℃以后酶活力损失较大。由图5可知,60 ℃下,1~10 h内酶活力较稳定,10 h后酶活力降幅较大。

2.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液,采用常规方法测定酶活力。此外,将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后,按常规法测定其对应的酶活力。由图6可知,β-葡萄糖苷酶活力随着pH值的上升先提高后降低,在pH值为5.0时酶活力最高,这与多数文献报道的一致。由图7可知,酶在pH值为4.0~6.0之间时,相对酶活力较高,保持了较高的稳定性,在pH值>6.0或pH值<4.0时,酶活力明显下降。

2.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 在标准条件下,用 0.5% 的不同底物与酶液反应,结果如表1所示。由表1可知,酶对虎杖苷的水解效果最好,对水杨苷的水解效果其次,对纤维二糖和京尼平苷的水解效果较差,对甜菊苷的水解效果最弱。

2.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂。在酶反应液中分别加入上述金属离子, 使其终浓度为 1.0 mmol/L, 于60 ℃温30 min,按常规法测定对应的酶活力,以不加金属离子的酶活力为100%。从表2可以看出,金属阳离子对该酶都有不同程度的影响,其中Fe2+、Na+和Ca2+对酶活力有轻微的激活作用,而Mg2+和Co2+则有一定的抑制作用。

3 结论

本试验通过初筛和复筛得到1株霉菌,可将虎杖苷转化为白藜芦醇,经形态学鉴定为青霉菌属。对其所产酶的酶学性质进行了研究,结果表明:酶的最适pH值为5.0,pH值在4.0~6.0之间时,酶的稳定性较好;酶最适反应温度为 60 ℃,并且在该温度下具有较好的热稳定性;Fe2+、Na+和Ca2+对酶活力有激活作用;虎杖苷是该酶理想的水解作用底物。

本试验的结果可以拓展白藜芦醇的制备途径[17],增加虎杖的利用价值。可以用虎杖中药材为原料,先提取虎杖苷,利用该菌株所产的酶液转化虎杖苷,或将酶液制成固定化酶再将虎杖苷转化成白藜芦醇。另外,还可以将虎杖药材粉碎后与该菌进行共发酵,从发酵后的固体曲中提取白藜芦醇。

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