ISTR标记在榧树种质资源遗传多样性分析中的应用

俞飞飞 周军永 陆丽娟

摘要：利用反向序列标签重复技术（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）对43份安徽省榧树种质资源及3份浙江省榧树资源进行了遗传多样性分析。ISTR能很好地用于榧树种质资源遗传多样性分析，多态性比例为87.09%，46份榧树种质遗传相似系数为0.548 4～1.000 0，表明安徽省榧树种质资源遗传多样性较为丰富。采用UPGMA（非加权组平均算法）对46份种质的ISTR数据进行聚类分析，结果显示可分为3个类群，来自同一地方的种质基本上都独立聚成类群，表明种质间亲缘关系与地理来源关系较为密切;相似的种质类型聚为一类，可能与实生繁殖方式有关。ISTR标记可在榧树种质资源遗传多样性分析中被广泛地应用。

关键词：香榧;反向序列标签重复技术;遗传多样性

中图分类号： S791.530.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0038-03

榧树（Torreya grandis）属裸子植物红豆杉科（Taxaceae）榧属（Torreya）常绿乔木，为第3纪孑遗植物，是我国特有的珍稀树种。安徽省榧树种质资源丰富，多呈野生或半野生状态，主要分布于黄山市的黟县、休宁县、歙县、徽州区和黄山区，宣城市的宁国市、宣州区和绩溪县，池州市的石台县有少量分布，此外，大别山区的霍邱、舒城等地也有零星分布[1-6]。

反向序列标签重复技术（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）是逆转座子的分子标记，较常规分子标记灵敏[7]，使用的是通用引物，免去了前期逆转座子特异引物开发步骤，降低了试验成本和提高了效率。目前已在椰子[8]、葡萄[9]、柑橘[10]和柿[11]等果树树种的指纹分析、遗传连锁图谱构建、系统进化分析和种质鉴定等研究中得到应用。

随着香榧经济价值的不断提高，榧树的种质资源开发和利用受到重视，特别注重优良品质的榧树资源利用，同时受到来自诸暨香榧等细榧品种的影响，安徽省很多野生和半野生的榧树被改接，从而造成榧树种质资源的流失，并且前人对安徽省榧树资源遗传多样性的研究很少。本试验拟探讨ISTR标记在榧树种质鉴定和亲缘关系分析中应用的可行性，以期为今后开展遗传多样性评价、雌雄性别鉴定、种质鉴定和亲缘关系分析等研究提供新的研究手段，对榧树资源的保存利用具有重要的研究意义。

1 材料与方法

本研究中所采用的榧树种质资源共46份（表1），于2017年6月采自安徽省榧树主产区的宁国市、黟县、宣城等地;其中诸暨香榧引自浙江省诸暨市。试验于2017年8月在园艺作物种质创制及生理生态安徽省重点实验室进行。

采用十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取榧树叶片DNA，DNA终浓度稀释至10 ng/μL备用。ISTR扩增及其产物检测参考Rohde的方法并作优化[8]。引物序列参考Aga等的报道[12]（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系（20 μL）：模板DNA（2 μL），Buffer 1×（5 μL），Mg2+ 2.5×10-3 mol/L（5 μL），dNTP 2.5×10-3 mol/L（5 μL），Taq酶1 U（1 μL），引物1.0×10-6 mol/L（2 μL）。扩增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，循環35次;72 ℃延伸5 min。扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用SYNGENE凝胶成像系统观察和记录谱带。

PCR扩增试验重复2次，不能重复的条带统计时忽略不计。强带、弱带均记为1，同一位置无带记为0，从而生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。用NTSYS-pc 2.10软件进行相似系数计算和基于非加权组平均算法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚类分析，构建树状图，分析榧树种质资源亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 ISTR多态性分析

共筛选12对引物，其中4对引物的扩增谱带清晰且重复性好。由表3可见，4对引物的扩增总带数为31条，27条（占87.10%）具多态性;扩增片段长度为100～5 000 bp;单引物对多态位点比例为77.78%～100%;不同引物组合的种质鉴定能力差异较大，4对引物组合可以将46份种质资源按来源地区分，证明ISTR可用于榧树种质资源遗传多样性研究。

2.2 品种及雌雄性鉴别

由4条引物扩增出的27个多态性位点，大多数谱带在供试材料间不具有独特性，来自宁国市方塘乡的种质资源和诸暨香榧多态性丰富，能与其他种质资源明显区分。图1结果显示， 17号样本为雄性榧树，在500 bp左右出现独特性扩增位点，与雌性榧树有明显区分，作为雌雄性鉴定的依据有待于进一步研究。

2.3 基于ISTR的相似指数及亲缘关系分析

46份榧树种质遗传相似系数为0.548 4～1.000 0，表明安徽榧树种质资源遗传多样性较为丰富，其中来自黟县的圆榧类种质的相似系数最大，为1.000 0，表明圆榧类的亲缘关系最近。

采用UPGMA法，根据相似系数对46份榧树种质进行聚类分析（图2），在相似系数为0.82时，46份种质可分为3个类群。第1类群包含2份种质，来自宁国市方塘乡。

第2类群包含7份种质，以相似系数0.87为界，可分为2个亚类，第1亚类包含4份种质，其中宁国市方塘乡3份，宁国市青龙乡1份;第2亚类含有3份种质，其中2份来自浙江省（诸暨香榧），1份来自安徽省宁国市方塘乡。

第3类群含有37份种质，以相似系数0.91为界，分为4个亚类。第1亚类包含30份种质，第2亚类仅含有1份种质（来自宣城市水东镇），第3亚类包含5份种质，全部来自宁国市青龙乡，第4亚类包含1份种质（来自宁国市青龙乡）。在相似系数0.94处，第1亚类可分为5小类，第1小类包含8份种质，其中2份种质来自宁国市，1份种质来自宣城市，5份种质来自黟县（5份种质聚为一类，且圆榧类种质亲缘关系近，聚为一类）;第2小类包含4份种质，3份来自宣城市，1份来自宁国市;第3小类包含17份种质，8份来自宣城市，1份来自浙江省（诸暨香榧），8份来自黟县，其中来自黟县的多为圆榧类种质，且聚为一类;第4小类仅包含1份种质（来自宣城市溪口镇）。

3 讨论

本研究中所使用的ISTR分子标记是基于椰子Ty1-copia逆转座子序列开发而来的[8，12]，试验的目的在于探讨ISTR分子标记在榧树种质资源中的适用性及其用于研究榧树资源亲缘关系的可行性。本试验中ISTR多态性比例为8709%，多态性比例较高，且关于榧树逆转座子标记未见报道， 使用通用引物较以特异性引物开发为前提的逆转座子标

记成本低，因此ISTR是较便捷的逆转座子标记。

本试验结果显示，46份榧树种质遗传相似系数为 0.548 4～1.000 0，榧树种质资源遗传多样性较为丰富。聚类分析结果显示第1类群全部来自宁国市方塘乡;第2类群包含7份种质，其中5份来自宁国市，2份来自浙江省（诸暨香榧）;46份种质中的37份属于第3类群，基本包含了所有的采样地区，其中第1亚类包含30份种质，第2亚类仅含有1份种质（来自宣城市水东镇），第3亚类包含5份种质，全部来自宁国市青龙乡，第4亚类包含1份种质（来自宁国市青龙乡）。第1亚类又分为5小类，第1小类包含8份种质，其中2份种质来自宁国市，1份种质来自宣城市，5份种质来自的黟县;第2小类包含4份种质，3份来自宣城市，1份来自宁国市;第3小类包含17份种质，8份来自宣城市，1份来自浙江省（諸暨香榧），8份来自黟县，其中来自黟县的多为圆榧类种质，且聚为一类;第4小类仅包含1份种质（来自宣城市溪口镇）。由于安徽省榧树资源分布呈现地域性，在相对独立的环境中进化;同一地理来源的种质间基因交流频繁，从而使亲缘关系较近，遗传变异系数相对较低;遗传距离与地理距离具有一定的相关性，安徽省榧树资源中来自同一区域的多聚为小类，但聚为一类的榧树种质并非都来自同一地区，这可能与地区之间的引种有关，也可能与本试验所选用的ISTR引物数量有限相关。此外，遗传多样性水平受繁育方式影响[13]，来自黟县的种质资源多为圆榧类，亲缘关系非常近，聚在一起，这可能与长期的实生播种繁殖方式有关。

本研究中所选的引物扩增出的多态性位点在供试材料间具有独特性，来自宁国市方塘乡的榧树种质资源遗传多样性较为丰富。利用F8/B6引物组合进行扩增时，17号样本（雄株）在500 bp左右出现独特性扩增位点，与雌性榧树有明显区分，其特异性位点扩增作为雌雄性鉴定的依据有待于进一步研究。

本研究中ISTR产物使用高浓度的琼脂糖凝胶电泳检测手段获得较好的结果，表明高浓度琼脂糖凝胶电泳可用于检测ISTR产物，提高了试验效率[11]。试验中发现用高浓度的琼脂糖凝胶电泳检测部分引物扩增结果时，条带有密集现象;目前报道多采用的聚丙烯酰氨凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）检测方式具有分辨率高等优点。因此，今后应依据试验目的、遗传背景等方面选择ISTR产物检测方式。

安徽省榧树种质资源丰富，其中不乏新发现的优良株系[1]，但野生榧树的低收益，使得农户疏于管理或改接为诸暨香榧，从而造成榧树种质资源的逐年减少，分析安徽省榧树种质的遗传多样性有助于了解其亲缘关系和从中筛选优良株系。本试验探讨ISTR标记在榧树种质鉴定和亲缘关系分析中应用的可行性，以期为今后开展遗传多样性评价、雌雄性别鉴定、种质鉴定和亲缘关系分析等研究提供新的研究手段，对榧树资源的保存利用具有重要的研究意义。

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