基于RNA-seq数据发掘响应干旱的谷子C2H2型锌指蛋白基因

齐帆 范兴 陈义

摘要：C2H2型锌指蛋白在植物响应逆境胁迫以及激素信号转导过程中起着重要作用，为了发掘响应干旱胁迫的谷子C2H2型锌指蛋白基因（SiC2H2），利用转录组测序技术构建谷子聚乙二醇（PEG）处理前后转录组文库，根据表达谱数据鉴定出11个SiC2H2差异表达基因，对其进行理化性质、启动子元件等部分生物信息学分析和进化树及基因结构分析。实时荧光定量逆转录PCR（RT-PCR）验证结果表明，随机选取的4个基因在PEG胁迫前后的表达特点与表达谱数据基本一致。研究结果为后续进一步研究C2H2型锌指蛋白在谷子抗旱性中的作用以及谷子抗旱分子育种提供了理论依据。

关键词：谷子;C2H2型锌指蛋白;干旱胁迫;差异表达基因

中图分类号： S515.01  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0041-05

干旱是我国粮食生产的重要制约因素之一，且干旱的频率和程度日趋严重，因此选育抗旱品种已成为育种的重要目标。谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]属禾本科狗尾草属，具有耐旱、耐瘠薄、适应性强、水分利用率高等特点，在作物抗旱种质资源利用方面具有其独特的研究价值[1]。谷子全基因组测序的完成为研究谷子功能基因组提供了平台[2-3]，发掘与鉴定谷子抗旱基因资源、探索谷子抗旱机制对于促进其基因资源的利用和抗旱育种有着极为重要的理论和實践意义。

锌指蛋白是植物转录调节子中最大的家族之一，具有指状结构且能结合锌离子[4]，其中的C2H2型锌指蛋白具有一段高度保守的氨基酸特征序列QALGGH，含有由大约30个氨基酸组成的锌指结构，该结构的保守序列为X2CX2～4CX12HX2～8H[5]。C2H2型锌指蛋白广泛参与调控植物的生长和发育[6-9]，而且越来越多的研究表明，C2H2型锌指蛋白在植物响应逆境胁迫过程中起着非常重要的作用，许多与植物胁迫耐受相关的C2H2型锌指蛋白已得到鉴定[10-12]。DNA芯片分析结果显示，拟南芥C2H2型锌指蛋白中Cl-2i类（Zat家族）的一些成员在各种生物和非生物胁迫下上调表达，其中2个被广泛研究的成员Zat10（STZ）和Zat12，能够被干旱、盐、渗透、温度、伤害、氧化和高光等胁迫所诱导;遗传分析结果也表明，Zat10和Zat12参与调节了活性氧清除基因的表达进而提高了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍耐力[6]。水稻中C2H2型锌指蛋白的部分成员，如ZFP245、ZFP252和ZFP179也被证明参与了水稻对干旱、盐和氧化胁迫的应激反应[13]。水稻ZFP182和ZFP36参与了脱落酸（ABA）诱导的抗氧化防护，在提高植物对水分胁迫以及氧化胁迫的忍耐力方面起到了重要的调节作用[14-15]。在烟草中过量表达矮牵牛C2H2型锌指蛋白基因ZPT2-3，明显提高了转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力[16]。目前已经在许多植物，如拟南芥、水稻、小麦、烟草中分离到近百个C2H2型锌指蛋白基因。

谷子作为我国重要的农作物之一，近年来已逐渐成为开展C4植物和抗旱耐逆研究的模式植物[17]。目前人们已经从谷子中鉴定出124个SiC2H2，它们大都参与非生物逆境胁迫响应[18]，然而具体哪些成员参与了干旱胁迫响应过程还不清楚，在这一过程中的具体作用和功能还有待于进一步研究。本研究拟通过转录组测序表达谱数据，从谷子中鉴定响应干旱胁迫的C2H2型锌指蛋白，筛选参与干旱胁迫应答的关键SiC2H2基因，以期为阐明C2H2型锌指蛋白在谷子抗旱性中的作用以及利用分子生物学手段提高作物的抗旱性奠定基础。

1 材料与方法

试验于2016年9月至2017年9月在山西农业大学农业生物工程研究所、杂粮基因与分子育种山西省高等学校重点实验室内完成。

1.1 试验材料

以谷子JF16为试验材料，其种子由山西农业大学农业生物工程研究所提供。将谷子在人工气候室中培养，采用体积比为3 ∶ 1的营养土、蛭石混合土种植，培养3周后，对谷子幼苗进行20% PEG-6000（聚乙二醇-6000）溶液模拟干旱胁迫处理，以蒸馏水处理作为对照，处理0.5 h后分别剪取幼苗植株叶片，迅速放于液氮中冷冻，用于转录组测序;同上，处理0、0.5、1、2、4 h后取材，用于实时荧光定量PCR验证。

1.2 SiC2H2差异表达基因的筛选

基因表达量用TPM值（transcripts per million，即每百万条reads的转录本）表示，运用R语言绘制基因的表达值热图。根据对照组和干旱处理组中基因的TPM值来比较不同处理间的基因差异表达。本研究中差异基因筛选标准为错误发现率（false discovery rate，简称FDR）≤0.001且差异倍数（fold change，简称FC）在2倍以上，即∣log2（fold change）∣≥1。

1.3 SiC2H2基因生物信息学分析

从谷子基因组数据库phytozome v 12.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中找出所有C2H2型锌指蛋白基因，并从转录组数据中查找到相对应的基因，提取其在基因组数据库中的基本信息;利用DNAMAN6.0预测蛋白质分子量和等电点等理化性质;用Plant CARE（http：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析SiC2H2基因启动子（起始密码子ATG上游1.5 kb的DNA序列）顺式作用元件;使用MEGA6.0构建SiC2H2氨基酸序列系统进化树;利用GSDS在线工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作SiC2H2基因结构图。

1.4 实时荧光定量RT-PCR分析

参照RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）使用说明，从各处理样品中提取总RNA以及合成cDNA。根据基因序列信息，采用软件Primer 5.0进行real-time RT-PCR特异性引物设计（表1）。使用美国Bio-Rad CFX96TM Touch Real-Time PCR System對基因进行相对定量RT-PCR分析。两步法PCR反应程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样品重复3次，以β-actin作为内参，用2-ΔΔCT的方法计算基因的相对表达量，基因在处理 0 h 时的相对表达量设定为1。

2 结果与分析

2.1 SiC2H2差异表达基因筛选

利用高通量转录组测序技术从表达谱数据中共得到44个SiC2H2基因，将这些基因在正常浇水对照组（control）与PEG模拟干旱处理组（PEG）中的表达量进行了标准化热图分析（图1），其中18个基因上调表达，25个下调表达，1个无差异表达。

为筛选鉴定响应干旱的关键SiC2H2基因，对正常浇水和干旱处理的表达谱进行比较，根据基因表达量（TPM值）计算该基因在同一品种不同处理间的差异表达倍数，以FDR≤0.001、∣log2（FC）∣≥1（即倍数差异在2倍以上）为筛选标准，共获得11个差异表达基因（图2），其中编号为Si017660m、Si022296m、Si023013m、Si003051m、Si037343m、Si037672m的基因在干旱胁迫下与对照相比上调表达，而编号为Si016736m、Si018078m、Si029540m、Si037164m、Si029897m的基因下调表达。

2.2 SiC2H2基本信息与理化性质

针对获得的11个差异表达基因，对其基本信息与理化性质进行了分析，如表2所示，它们分别位于第1、2、3、5、9号染色体上，基因序列长度处于844～7 484 bp之间，平均长度为2 652 bp;氨基酸序列长度处于184～585个之间，平均长度为332个，分子量处于19.4～60.2 ku之间，平均分子量为 352 ku;理论等电点为6.05～ 9.17，平均为7.12。

2.3 SiC2H2进化树及基因结构分析

谷子C2H2型锌指蛋白家族成员分成5个亚家族，本研究使用MEGA6.0软件中的Neighbor-Joining算法对11个SiC2H2氨基酸序列构建系统进化树，发现它们分别属于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ亚家族，基因结构分析显示，同一亚族的基因具有相似的外显子-内含子结构（图3）。

2.4 SiC2H2基因启动子元件分析

启动子是基因表达与调控的“分子开关”，对启动子顺式作用元件的分析将有助于研究该基因的表达调控机制及其生物学功能。如表3所示，11个SiC2H2基因启动子区包含多种激素响应顺式作用元件，如核心序列为CACGTG的脱落酸应答元件ABRE、水杨酸应答元件TCA-element、乙烯应答元件ERE、赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif及生长素应答元件TGA-element;同时包含多种参与植物非生物逆境胁迫响应的顺式作用元件，如干旱诱导相关的MYB结合位点MBS、热激应答元件HSE、参与低温响应的顺式作用元件LTR以及参与防御和胁迫响应的元件 TC-rich repeats。每个基因至少含有6个与激素及胁迫应答相关的顺式作用元件，并且所有基因都含有与干旱胁迫响应相关的ABRE作用元件或者MBS作用元件，表明这些SiC2H2基因极有可能参与调控谷子生长发育及胁迫应激反应，尤其是干旱胁迫响应。

2.5 SiC2H2基因荧光定量RT-PCR验证

为了进一步验证表达谱中响应干旱的SiC2H2基因表达特性，以PEG处理0、0.5、1、2、4 h的谷子幼苗为材料，随机筛选4个基因Si037343m、Si023013m、Si022296m、Si037164m，使用实时荧光定量PCR技术对它们的基因表达情况进行验证。如图4所示，4个基因在PEG干旱胁迫处理条件下的表达趋势与表达谱数据结果基本吻合，说明表达谱数据可靠，可用于后续研究。

3 讨论与结论

干旱是世界范围内严重的环境胁迫因子，为保证全球人口日益增加的粮食供应，在干旱条件下最大限度地提高作物产量潜力、保持作物产量稳定是十分重要的。植物感知和应对干旱胁迫的机制非常复杂，在耐旱胁迫反应过程中许多干旱响应基因被激活，其中植物C2H2型锌指蛋白作为植物转录因子大家族之一，广泛参与了植物生长发育与逆境胁迫信号转导，许多C2H2型锌指蛋白介导的干旱胁迫响应过程被发现。最近的研究表明，拟南芥ZAT18在干旱胁迫下相应基因表达量显著上调，过表达植株与对照相比具有更强的耐旱性，ZAT18在干旱胁迫响应过程中起到正调控作用[19]，而大豆中的1个具有QALGGH保守结构域的C2H2型锌指蛋白GmZFP3则通过ABA依赖途径负调控植物对干旱胁迫的响应[20]。甘薯IbZFP1通过参与调控ABA信号转导、脯氨酸合成及活性氧清除进而增强了转基因拟南芥对盐胁迫与干旱胁迫的耐性[21]。

随着全基因组测序的完成，目前在谷子中发现124个C2H2型锌指蛋白家族成员[18]，本研究通过分析谷子PEG处理叶片转录组，进一步研究了其中11个响应干旱的差异表达基因，其中6个在干旱胁迫下上调表达，5个下调表达，并对这11个应答干旱胁迫的SiC2H2基因进行了理化性质等生物信息学分析。这些SiC2H2基因启动子序列区中含有多种与逆境以及激素相关的顺式作用元件，其中大多数基因都具有脱落酸应答元件ABRE、干旱诱导相关的MYB结合位点MBS以及茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif，说明它们极有可能通过依赖ABA途径或者非ABA依赖途径信号转导过程来调控植物对干旱胁迫的响应。使用荧光定量RT-PCR对4个随机选择的基因进行表达情况检测，它们在PEG胁迫下的表达特性总体趋势与表达谱测序结果基本是吻合的，但在具体表达量上调或下调倍数以及出现峰值的时间点上存在差异，这可能与所取材料、数据分析方法及检测灵敏度等不同有关。

本研究基于PEG干旱脅迫谷子叶片转录组测序数据，鉴定出44个SiC2H2基因，并对其中11个差异表达基因进行生物信息学分析及实时荧光定量RT-PCR验证，研究结果为从转录组水平揭示谷子响应干旱胁迫的分子调控机制提供了理论依据。

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