4种方法检测8个菊花品种花粉活力的比较

涂清芳 贾雪晴 姜自红

摘要：花粉活力是杂交育种能否成功的决定因素之一。研究4种方法测定8个菊花品种的花粉活力。结果表明，8个菊花品种中，迟黄花粉活力最高，其次为杭白菊，再次为黄山贡菊和白/黄香梨，然后为滁菊和亳菊;白金菊花粉活力较低，金丝皇菊花粉活力最低，部分品种间花粉活力存在显著差异（P<0.05）;对于滁菊和杭白菊，3种快速测定法中，I2-KI法的测定值更接近离体萌发法，而关于I2-KI法是否为菊花花粉快速测定的最佳方法，仍需进一步试验。

关键词：菊花;花粉活力;测定方法

中图分类号： S682.1+10.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0109-03

菊花[Dendranthema morifolium （Ramat. ）Tzvel.]是中国的传统名花，其观赏价值高，历来受到中国文人雅士的推崇和百姓的喜爱。随着育种技术的发展，现在已有数千个园艺品种，应用方式多种多样，更是产生了较高的经济价值和社会效益。在菊花的众多育种方法中，杂交育种是最基本、最常用、最简单且最有成效的方法[1-4]。授粉是影响杂交育种结实率的重要因素[5]。花粉是被子植物的雄配子体，在植物的有性繁育过程中发挥着重要作用。父本具有良好的花粉活力是菊花成功进行杂交育种的重要条件。本试验通过运用多种花粉活力快速测定法和离体萌发法测定8个菊花品种（或变种）的花粉活力，以初步判断其花粉细胞活性，为菊花杂交育种组合方案的制定提供参考依据，同时还可比较不同花粉活力测定方法的优劣，为菊花花粉活力测定方法的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料编号、品种及材料来源见表1，主要来自南京农业大学的资源圃。2017年11月正值各品种菊花盛花期间，选择晴天的上午采集各品种盛开的花序，带回实验室取花粉进行试验。

1.2 试验时间和地点

所有试验选择在2017年11月15—21日期间，正值菊花的盛花期，在滁州职业技术学院志勤楼2202实验室完成。

1.3 方法

1.3.1 快速测定花粉活力

1.3.1.1 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法 称取0.03 g TTC 溶解在10 mL磷酸盐缓冲溶液中， 置于棕色试剂瓶中待用。将1～2滴TTC溶液滴于凹面载玻片的凹陷处，取新鲜花粉散置其中，盖上盖玻片。然后放于35 ℃恒温箱中，染色20 min左右，进行镜检，有生活力的花粉粒呈红色，有微弱活力的花粉粒呈淡红色，无活力或不育的花粉无色[6]。每个品种做3个玻片，每个玻片取5个固定大小的视野进行统计，每个视野中的花粉粒数不少于50粒。花粉活力=被染为红色的花粉数量/总花粉粒数量×100%。

1.3.1.2 醋酸洋紅染色法 配制1%醋酸洋红溶液，置于棕色试剂瓶中待用。取少量新鲜花粉置于凹面载玻片凹陷处，滴1～2滴醋酸洋红溶液，盖上盖玻片，染色5～10 min，镜检，呈深红色的花粉粒有生活力，呈淡红色的则无生活力[7]。同样，每个品种做3个玻片，每个玻片取5个视野进行统计。

1.3.1.3 I2-KI染色法 配置2% I2-KI溶液，置于棕色试剂瓶中待用。取少量新鲜花粉置于凹面载玻片凹陷处，滴2滴I2-KI溶液染色，5 min后在显微镜下观察。同样，每品种做3个玻片，每个玻片取5个视野进行统计。有生活力的花粉呈蓝色，生活力衰弱的花粉或内含物少的花粉呈黄褐色。花粉活力=蓝色花粉数量/总花粉数量×100%[8]。

1.3.2 离体萌发法测定花粉活力 配制配方为100 g/L蔗糖+50 mg/L 硼酸+30 mg/L CaCl2+7 g/L琼脂+200 g/L PEG4000的固体培养基，在凝固前用移液枪移取100～150 μL 滴于凹玻片凹陷处，取花粉散置于培养基上，然后放入底部有潮湿滤纸的培养皿中，在20 ℃黑暗条件下培养2 h以上。在显微镜下检测花粉萌发情况[9]。花粉管长度大于花粉直径视为花粉粒萌发标准，否则视为不萌发[10]。萌发 率= 萌发的花粉数量/检测的花粉粒总数量×100%。

1.3.3 花粉活力测定方法比较 相对于各种花粉活力快速测定法，花粉离体萌发法的测定结果更接近真实情况。故以花粉萌发法为依据，比较TTC法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法的测定值，以确定适于菊花花粉活力的快速测定方法[11]。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，每次重复统计5个视野，所得试验数据采用Excel 2003和SPSS 20.0软件进行处理[12]。

2 结果与分析

2.1 TTC法测定8个菊花品种的花粉活力比较

用TTC法检测8个菊花品种的花粉活力，花粉被染成红色和淡红色，仔细观察使能区分是否有活力。花粉活力排名前3位的品种分别是迟黄、杭白菊和滁菊，活力排名最后2位的是白金菊和金丝皇菊（表2）。经方差分析，其中杭白菊与滁菊差异不大，差异没有统计学意义（P>0.05）;白/黄香梨与滁菊差异不大，差异没有统计学意义（P>0.05）;亳菊与黄山贡菊差异不大，差异没有统计学意义（P>0.05）。除此之外，其他品种的花粉活力两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 醋酸洋红染色法测定8个菊花品种的花粉活力比较

用醋酸洋红染色法检测8个菊花品种的花粉活力，花粉基本被染成深红色，极少为浅红色，花粉活力明显偏高，其中迟黄、黄山贡菊和滁菊的花粉活力高达100.0%。而活力排名最后的金丝皇菊，花粉活力也高于90.0%。经方差分析，其中白金菊、白/黄香梨、杭白菊、滁菊、黄山贡菊、迟黄6个品种的花粉活力两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）（表3）。

2.3 I2-KI染色法测定8个菊花品种的花粉活力比较

用I2-KI法检测8个菊花品种的花粉活力，染色结果比较清晰，蓝色和黄褐色的花粉容易区分。花粉活力排名前3位的分别是杭白菊、迟黄和黄山贡菊，活力排名最后2位的是白金菊和金丝皇菊（表4）。经方差分析，其中滁菊、白/黄香梨、黄山贡菊3个品种的花粉活力两两比较差异无统计学意义（P>0.05）;迟黄和杭白菊比较差异无统计学意义（P>0.05）;除此之外， 其他品种的花粉活力两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.4 离体萌发法测定8个菊花品种的花粉活力比较

用离体萌发法检测8个菊花品种的花粉活力，萌发花粉管的花粉数量不多，整体花粉活力较快速检测法的测定值低，其中排名前3位的是迟黄、白/黄香梨和杭白菊，排名最后2位的是白金菊和金丝皇菊（表5）。经方差分析，其中杭白菊、白/黄香梨、黄山贡菊3个品种的花粉活力两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）;滁菊和黄山贡菊比较差异无统计学意义（P>0.05）;亳菊和白金菊比较差异无统计学意义（P>0.05）;除此之外，其他品种的花粉活力两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

4种方法测定8个菊花品种的花粉活力比较结果见图1。其中，不同染色方法对菊花品种花粉活力的测定效果见图2。

2.5 3种快速测定花粉活力方法的比较

3种快速测定花粉活力的方法简便易行，但准确度不高，而离体萌发法测定花粉活力更接近真实结果。由于醋酸洋红法检测花粉活力，测定值普遍很高，明显失真，首先将其排除。因此，以滁菊、杭白菊、亳菊3个菊花品种为例，以离体萌发法的测定值为参照，将TTC法、I2-KI染色法快速测定花粉活力的测定值和其进行比较，以选出适宜菊花的花粉活力快速测定的方法。因数据不具有方差齐性，选择Dunnetts T3进行两两分析的比较，结果见表6。

由方差分析可得，F滁菊=344.68，F杭白菊=502.47，F亳菊=323.65，P<0.001。进一步进行Dunnetts T3检验，亳菊的TCC法与I2-KI法检测所得花粉活力之间无显著性差异，无统计学意义。滁菊和杭白菊的TCC法与I2-KI法、TCC法与离体萌发法、I2-KI与离体萌发法检测结果之间均具有统计学意义，存在显著性差异（P<0.05）。根据表6的数据，可以在一定程度上认为，滁菊和杭白菊在花粉活力的快速检测方法上，I2-KI法的测定值更接近离体萌发法。

3 讨论与结论

3.1 8个菊花品种的花粉活力比较

4种方法测定的8个菊花品种的花粉活力值各不相同，其中迟黄在3种方法中排序第1，在另一种方法中排序第2;杭白菊在4种方法中均排序前4;黄山贡菊和白/黄香梨在3种方法中均排序前4;白金菊在3种方法中均排序第7;金丝皇菊在4种方法中均排序第8。因此，整体比较可认为，8个菊花品种中，迟黄的花粉活力最高，其次为杭白菊，再次为黄山贡菊和白/黄香梨，然后为滁菊和亳菊，金丝皇菊的花粉活力最低，且和其他品种均有显著性差异，另外，白金菊的花粉活力也较低。从理论上讲，花粉活力较低的金丝皇菊和白金菊不适宜选作杂交育种的父本。在本试验中，金丝皇菊和白金菊测得的花粉活力较低。从形态上看，金丝皇菊的花粉量少，白金菊的花粉被花被包围不易取，取花粉时这2个品种的花粉更容易受操作及外界影响。这在一定程度上也许会影响花粉活力，但尚属推论，需要进一步试验。

3.2 花粉活力测定方法的比较

首先，离体萌发法测定菊花花粉活力比快速测定法的结果更真实。而3种快速测定花粉活力方法的测定值均偏高，并不能反映花粉本身的可育性和受精力。其中，醋酸洋红法的测定值过高，参考价值不大。将滁菊、杭白菊、亳菊的TCC法、I2-KI法与离体萌发法测定的花粉活力，通过Dunnetts T3进行两两比较和检验，对于滁菊、杭白菊来说，可以认为3种方法中，I2-KI法的测定值更接近离体萌发法。而对于亳菊来说，尚不能得出这个结论。

另外，快速測定花粉活力的方法还有MTT染色法、联苯胺染色法等，因此关于I2-KI是否确实为菊花快速测定花粉活力方法中更接近离体萌发法的方法，仍需要进一步验证。

参考文献：

[1]陈秀兰，冯玲秀，童 华. 小菊杂交育种效果的探讨[J]. 江苏农业科学，1990（6）：48-50.

[2]郭天亮，李春志，柴风琴，等. 菊花（秋菊）人工杂交育种试验[J]. 林业科技开发，2003，17（5）：61-62.

[3]卢 钰，刘 军，丰 震，等. 菊花育种研究现状及今后的研究方向[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），2004，35（1）：145-149.

[4]王丽君，王彩君. 浅谈菊花育种及其发展现状[J]. 北方园艺，2007（8）：161-163.

[5]赵剑颖，张华丽，张西西，等. 万寿菊花粉活力及柱头可授性研究[J]. 中国农学通报，2012，28（19）：159-163.

[6]赵凯歌，曾雪梅，张云芬，等. 蓝眼菊花粉生活力测定与贮存方法研究[J]. 广东园林，2009（5）：67-69.

[7]王 涛，董玉芝，高英旭，等. 地被菊花粉生活力测定方法的筛选[J]. 农业科技与装备，2010，190（4）：15-17.

[8]刘 伟，丁长春，沐建华. 淡黄花百合花粉活力及其测定方法比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（4）：198-199.

[9]赵宏波，陈发棣，房伟民. 栽培小菊和几种菊属植物花粉离体萌发研究[J]. 南京农业大学学报，2005，28（2）：22-27.

[10]赵永平，张肖凌，魏玉杰，等. 不同方法检测金盏花花粉生活力比较研究[J]. 现代农业科技，2008（22）：13-14.

[11]韩成刚，盖树鹏. 芍药花粉活力测定方法的研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（5）：124-126.

[12]胡 春，刘左军，李富香，等. 钝裂银莲花花粉活力测定方法的研究[J]. 植物研究，2013，33（5）：582-586.