植物乳杆菌对卷烟品质的影响

米其利 杨娟 徐玉琼

摘要：为了提升烟叶品质，从中国传统发酵食品酸萝卜中分离筛选到1株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L15。将菌体悬液发酵烟丝以及对发酵产香条件进行优化，感官评吸结果表明，L15处理能有效提升烟叶的香气，降低卷烟的杂气、苦辣味和刺激性，改善余味，突显酸香味;最佳产香条件为：接菌量1×109 CFU/mL、发酵温度37 ℃、菌龄20 h，烟叶产地贵州福泉。发酵后烟丝主要化学成分比例更加平衡。致香成分分析表明，L15发酵使化合物数量从46个减少至42个，含量变化较大的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮。表明植物乳杆菌L15能有效改善烟叶的内在质量，提升卷烟抽吸品质。

关键词：植物乳杆菌;陈化;卷烟品质;致香成分

中图分类号： TS44+4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0177-04

烟叶陈化是在一定温度和湿度条件下，烟叶理化特性发生深刻变化，烟叶香气、色泽和吸味品质明显改善的一个重要卷烟生产加工过程。烟叶陈化分为自然陈化和人工陈化。人工陈化速度快，但发酵后烟叶内各种成分比例不协调，至今已经很少采用。自然陈化发酵效果好，但耗时长，场地占用大，资金积压多，导致生产成本提高。在烟叶的陈化过程中，微生物扮演着重要角色。Reid等率先发现，雪茄烟叶表面存在大量细菌、霉菌[1]。朱大恒等从中国烤烟烟叶中成功分离到大量微生物，包括占绝对优势的细菌、少量放线菌和真菌[2]。目前，随着高通量测序技术应用于烟草行业，陈化烟叶表面更多微生物种类得到了鉴定[3-4]。

烟叶表面存在的复杂微生物群落不仅可以加速烟叶发酵，还可以降低烟叶中有害成分，如烟碱、亚硝胺等[5-6]，以及改善和提高烟叶的吸食品质[7-9]，所以在烟叶陈化过程中添加外源微生物进行发酵，以便快速改善烟叶品质是烟草科技开发的重要课题。Izquierdo等在19世纪60—70年代发现，利用单种或多种微生物发酵烟叶，能使烟叶的香气质得到显著改善[10-11]。黄静文等发现，经短小芽孢杆菌（Bacillus pumilum）发酵后的烟叶，烟香增加，刺激性降低，卷烟吸食味显著改善[12]。陈兴等发现，西姆芽孢杆菌（B. siamensis）能有效改善烟叶内在质量，提升卷烟抽吸品质[13]。此外，利用微生物发酵液改善烟叶品质和香气的报道较多。李雪梅等利用微生物菌株Nic22的发酵上清液处理烟叶，结果表明，处理后卷烟的杂气和刺激性减轻，抽吸品质显著提高[14]。

乳酸菌是公认的食品级安全微生物，广泛应用于酸奶、果汁、馒头等食品的风味塑造。目前，用于烟叶发酵的微生物大多分离自烟叶表面或土壤，有些是条件致病菌[4]，存在一定的安全隐患。食源性有益菌用于烟叶发酵的报道不多，而利用乳酸菌改善烟叶品质的报道较少。甄达文等在制备烟用香料时发现，烟叶碎片经酶处理以后，用德氏乳酸菌（Lactobacillus debrueckii）和生香酵母组合发酵制得的香料，增香效果明显[15]。潘家华等研究表明，由植物乳杆菌（L. plantarum）和醋酸杆菌（Clostriolium themoacidophilus）组成的复合微生物制剂发酵烟叶后，卷烟的陈化酸香和柔和细腻烟气均增加，刺激性降低，吸食口感变好[16]。

本研究从中国传统发酵食品酸萝卜中筛选到1株植物乳杆菌，将其菌悬液用于烟叶发酵，优化其发酵产香条件，并检测发酵对烟叶化学成分和致香成分的影响，为利用食品级乳酸菌改善烟叶品质，提升卷烟吸食质量及塑造新型风味卷烟等方面提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 烟叶 由云南中烟有限责任公司原料部提供，品种为K326，在仓库中已自然陈化1年。

1.1.2 MRS培养基 蛋白胨10 g/L、牛肉粉8 g/L、酵母粉 4 g/L、葡萄糖20 g/L、吐温80 1 mL/L、K2HPO4 2 g/L，NaAc 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4 0.5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L，pH值6.2，灭菌条件为115 ℃，20 min。如需配成固体，在液体培养基中添加15 g/L琼脂。

1.1.3 改良MRS固体培养基 MRS液体培养基中添加 10 g/L CaCO3、0.4 g/L溴甲酚紫和15 g/L琼脂。

1.1.4 烟叶培养基 将1年陈化龄烟叶研磨成粉末，在 100 mL 培养基中加入0.8 g烟叶粉末和1.5 g琼脂，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，用于筛选以烟叶为唯一营养源的乳酸菌。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离与鉴定 从湖南怀化采集酸萝卜样品若干份，利用改良MRS固体培养基筛选乳酸菌，单菌落保存在-80 ℃冰箱中。随机选取6株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37 ℃培养48 h。将长势最好的1株乳酸菌在MRS固体培养基中培养48 h，观察菌落形态，并按照常规细菌鉴定方法[17]进行生理生化特性分析。利用细菌基因组提取试剂盒（百泰克，中国）提取L15基因组DNA，用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增L15 16S rDNA基因，并送往昆明硕擎生物技术有限公司进行測序。PCR扩增条件为：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32个循环;72 ℃ 6 min。序列信息提交至NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行在线比对分析。综合形态、生理生化和分子鉴定结果确定菌株身份。

1.2.2 菌株生长曲线和产酸曲线 从-80 ℃冰箱中取出菌株保藏液，按0.4%（体积比）接种至5 mL MRS液体培养基中进行活化。活化好的菌液按0.4%（体积比）接种于100 mL MRS液体培养基中，30 ℃静止培养40 h。每隔2 h取4 mL菌液，用于D600 nm、pH值测定和活菌数分析。试验重复3次。

1.2.3 烟丝发酵和发酵条件优化 用切丝机将烟叶切成烟丝，称取含水率为12%的烟丝30 g，喷施6 mL浓度为1.0×109 CFU/mL、菌龄为20 h的乳酸菌菌悬液，对照样品喷施等量无菌水。将处理后的烟丝和对照装入无菌食品袋中，于温度为37 ℃、60%恒温恒湿培养箱中发酵7 d。然后，将烟丝制成卷烟，用于后续感官评吸。为获得最佳发酵条件，基于感官评吸，通过正交试验进行优化。

1.2.4 感官评吸 将发酵卷烟和对照随机编号，在恒温恒湿培养箱中平衡24 h后，由6名专家进行评吸。卷烟感官质量用香气质、香气量、浓度、劲头、刺激性、余味、杂气量、燃烧性和灰色等9个指标进行评价，得分越高，抽吸品质越好。每个样品重复评吸3次。

1.2.5 主要常规化学成分测定 采用连续流动分析法，参考行业标准YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 468—2013，分别测定总糖含量、还原糖含量、总氮含量、总植物碱含量。

1.2.6 挥发性成分分析 利用顶空-固相微萃取技术分离挥发性化合物，每次萃取的烟样为0.5 g，温度为60 ℃，时间为40 min。气相色谱条件：色谱柱为DB-WAXetr型毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）（Agilent，美国）;程序升温为初始温度60 ℃，保持5 min，第1阶升温速率2 ℃/min，终温 200 ℃，第2阶升温速率10 ℃/min，终温240 ℃，保持 10 min;进样口温度180 ℃;载气为高纯氦气;恒流模式，柱流量1.5 mL/min，分流比10 ∶ 1。质谱条件：电离方式为电子轰击源;电离能量70 eV;传输线温度180 ℃;离子源温度 200 ℃;溶剂延迟4 min;质量范围33～400 amu。对采集到的质谱图利用Wiley和NIST谱库进行串联检索，确定化合物身份，并利用峰面积归一化法计算各化学成分在样品中的相对含量。

1.3 数据分析

采用SPSS 22软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌筛选和鉴定

在改良MRS固体平板上，菌落颜色为乳白色或淡黄色，菌落周围有明显溶钙圈，溴甲酚紫变为黄色，这些单菌落初步确定为乳酸菌。在6株乳酸菌中，4株能在烟叶固体培养基上生长，将长势最好1株命名为L15，作为后续试验菌株。L15菌落形态规则，淡黄色，表面光滑、边缘整齐;菌株显微形态为短杆状、无鞭毛。生理生化测定结果见表1。分子生物学鉴定结果显示，L15与L. plantarum 16S rDNA序列具有>99%同源性。形态、生理生化和分子鉴定结果表明，L15为植物乳杆菌。

2.2 菌株L15生长和产酸特性

生长曲线分析显示，L15从4 h进入对数生长期，在18 h进入稳定生长期，30 h后菌落数和D600 nm值开始下降，推测其可能开始进入衰亡期（图1）。产酸曲线分析发现，在最初接菌到对数生长初期pH值维持6左右，然后在对数期急剧下降，最后从对数生长期末期到衰亡期维持在3.4～3.5（图1），说明L15具有很强的产酸能力。

2.3 感官评吸

按照试验方法所述进行感官评吸，试验结果，L15处理能显著改善卷烟吸食品質，表现为对照样品的烟气质粗糙，杂气大，刺激感凸显，余味苦辣，化学味较强，而L15发酵卷烟的香气质提升，烟气柔和，杂气、刺激性和苦辣味减轻，酸香味凸显，余味改善。在总评分为50分情况下，发酵卷烟的分值为32.39分，明显高于对照的29.33分。

2.4 产香发酵条件优化

基于感官评吸，对L15发酵条件进行优化。选取接菌量、发酵温度、菌龄、烟叶产地4个因素进行正交试验[L8（3×23）]（表2）。正交试验结果见表3。从表3可以看出，接菌量为1×109 CFU/mL、发酵温度为37 ℃、菌龄为20 h、烟叶产地为贵州福泉时，发酵卷烟的感官评吸值最高，分别比未优化和对照高0.42、3.48分，表明A2B2C2D2组合为L15的最适产香发酵条件。

2.5 烟丝主要常规化学成分分析

经L15处理后，烟丝中的总氮含量、总植物碱含量变化不明显，但总糖含量极显著降低，总还原糖含量显著减少，导致糖氮比由10.11降低至9.29，糖碱比由9.16降低至8.63（表4）。

2.6 致香成分分析

从表5可以看出，L15发酵卷烟致香成分的种类主要包括酸、酮、醛、醇等4个大类，它们的含量均超过了10%。从化合物的种类来看，对照样品共鉴定出46个挥发性化合物，包括4个酸、13个酮、9个醛、8个醇、2个酯、2个烯、2个苯、2个呋喃、4个其他挥发性化合物，L15发酵卷烟对应挥发性化合物数量分别为5个酸、14个酮、9个醛、6个醇、1个酯、烯和苯为0、2个呋喃和5个其他挥发性化合物。从化合物的含量来看，总酸、总醇和总酯含量增加，总醛、总酮、总烯、总苯和总呋喃含量减少;含量较多且变化很明显的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮，其中乙酸含量增加了18.5百分点，3-甲基丁醛含量减少了10.96百分点，2-己酮从7.33%减少为0。另外，有些化合物，例如丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃等，它们的含量虽然较少，但处理与对照烟样间存在显著性差异。这些化合物的改变可能是L15改善烟叶吸食品质的主要原因。

3 讨论与结论

在烟叶陈化过程中，添加外源微生物进行发酵，能减轻卷烟杂气和刺激性，提高吃香味，改善烟叶品质[9-11，17]。本研究结果，即植物乳杆菌L15发酵处理后的卷烟，香气质提升，烟气柔和，杂气、刺激性和苦辣味减弱，酸香味凸显，余味改善，说明植物乳杆菌能改善烟叶吸食品质。由于乳酸菌的安全性，利用乳酸菌塑造特征风格卷烟潜力巨大。

烟叶化学成分是卷烟吸食味的物质基础。微生物发酵会加速烟叶化学成分变化，缩短陈化时间。瞿娇娇等发现，食源性芽孢杆菌能明显改善烟叶品质，发酵处理后烟叶的总糖含量、糖氮比、糖碱比均下降[18]，本研究结果与其高度相似。由于乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌，L15处理造成总糖含量、总还原糖含量减低应该归因于L15发酵产酸。L15发酵引起主要化合物含量的改变，可能使烟叶的糖、氮和碱等比值更趋于平衡，促进烟叶品质改善。

通过发酵，烟丝中致香物质种类由46个减少至42个，这些含量从无到有或从有到无的化合物，除了2-己酮外，含量均很少。发酵后烟丝的总酸含量尤其是乙酸含量、总醇含量和总酯含量增加，总醛含量尤其是3-甲基丁醛含量、总酮含量尤其是2-己酮含量、总烯含量、总苯含量、总呋喃含量减少，说明在L15的作用下，烟叶中的化合物可能进行了相互转化。酸类致香物质能去除杂气，改善口感，减轻刺激，醇类致香物质使卷烟香气细腻，酯类致香物质能掩盖焦苦气息，改善烟气吸味[19-20]。这些致香物质含量变化可能是L15发酵卷烟吸食品味高于对照的重要原因之一。但烟叶品质的高低是多种因素综合作用的结果，L15改善卷烟品质的机制还需要进一步研究阐明。

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