动植物中DNA甲基化的研究进展

曹婷婷 何航

摘 要 DNA甲基化是将DNA基团加入DNA分子的过程，作为一种重要的非永久性但相对长期可遗传的基因修饰，在维持细胞正常的转录活性、DNA 损伤修复能力以及在遗传印记、胚胎发育和肿瘤的发生发展中都有不可替代的作用，是分子生物学及医学领域的研究热点。本文总结了近年来对DNA甲基化的相关研究，归纳了DNA甲基化的保守功能、在动植物中甲基化研究、在疾病中的甲基化研究和DNA甲基化的应用，以期对DNA 甲基化这一表观遗传学热点进行深入的学习探讨。

关键词 DNA；甲基化；基因修饰

1 引言

DNA甲基化是指将DNA基团加入到DNA分子的过程，这一过程可以在不改变序列的情况下改变DNA片段的活性，当其位于基因启动子中时，常可以抑制基因转录。DNA甲基化与基因组印记，X染色体失活，转座因子的抑制、衰老和癌发生等正常发育中的关键过程密切相关，因此被认为非常重要。

胞嘧啶和腺嘌呤等两个碱基可被甲基化。胞嘧啶甲基化广泛存在于真核生物和原核生物之中，其甲基比化率有很大的物种差异，其中14%的胞嘧啶在拟南芥中甲基化；8%在绒泡菌；4%在家鼠；2.3%在大肠杆菌中。在植物中，近来发现的数量和种类也逐渐增多，DNA甲基化及其许多DNA甲基转移酶被认为是从原始RNA甲基化发展而来。

2 动植物体中的甲基化

2.1 动物体中的甲基化

DNA甲基化模式在哺乳动物亲子传递时几乎被消除，而后再重建，即父母已形成的甲基化不会传递到子代，而是在配子形成及胚胎早期发生中两次发生去甲基化和重新甲基化的过程。在最初的受精卵，以及桑椹胚和囊胚的開始几个分裂周期中发生去甲基化，而后在植入胚胎时产生甲基化波动，其中CpG岛被保护免于甲基化。由此可表现为全局抑制，仅允许管家基因广泛表达。胚胎植入后期，甲基化模式具有阶段性和组织特异性等特点，因此，每个单独的细胞类型在长时间内稳定持续[1]。

尽管DNA甲基化本身对于转录沉默本身不是必需的，但是仍将其当做是转录绝对失活的状态的锁定特征。尤其在基因组印记和X染色体失活的背景下，DNA甲基化在沉默单等位基因时起到关键作用[2]。表达和沉默等位基因的甲基化状态不同，DNA甲基化的丧失是导致Xist在体细胞中的印记和重新表达的原因。胚胎发育时期，几乎没有基因改变其甲基化状态，而在种系中特异性表达的许多基因例外。由于三种中任一种感受态DNA甲基转移酶被敲除均会发生死胎或产后死亡的情况，由此可知DNA甲基化在细胞分化时是必需的。而在胚囊的内细胞团、生殖细胞或胚胎干细胞这类未分化细胞中，DNA甲基化则并不必需。另外，DNA甲基化仅调节一部分基因，因此，其缺失是否准确致使分化细胞死亡尚需进一步研究。

由于基因组印记的现象，母本和父本基因组被差异标记，并且必须在每次生殖细胞形成时进行重新编辑，即根据其所传递亲本的性别删除、重建原有的甲基化模式。配子形成后，除与印迹基因相关的区域，亲代DNA将重复去甲基化和再甲基化过程。这一过程是形成胚胎全能性和消除表观遗传变化的关键因素[2]。

2.2 植物体中的甲基化

植物体中的甲基化在理解模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的DNA甲基化方面取得了重大进展。植物中的DNA甲基化不同于哺乳动物，哺乳动物中的DNA甲基化主要发生在CpG位点的胞嘧啶核苷酸上，在植物中胞嘧啶可在CpG，CpHpG和CpHpH位点甲基化，其中H代表任何核苷酸但不代表鸟嘌呤。总体而言，拟南芥 DNA是高度甲基化的，质谱分析估计有14%的胞嘧啶被修饰。将甲基转移并共价连接到DNA上的主要拟南芥 DNA甲基转移酶是DRM2，MET1和CMT3。DRM2和MET1蛋白分别与哺乳动物甲基转移酶DNMT3和DNMT1具有显着的同源性，而CMT3蛋白是植物界独有的。目前有两类DNA甲基转移酶：

（1）从头类，或在DNA上产生新的甲基化标记的酶；（2）维持类别，其识别DNA亲本链上的甲基化标记，并在DNA复制后将新甲基化转移至子链。

DRM2是唯一被认为是从头的酶DNA甲基转移酶。还显示DRM2与MET1和CMT3一起参与通过DNA复制维持甲基化标记[3]。目前尚不清楚细胞如何确定从头DNA甲基化的位置，但有证据表明，对于许多（尽管不是全部）位置，涉及RNA指导的DNA甲基化（RdDM）。在RdDM中，特定RNA转录物由基因组DNA模板产生，并且该RNA形成称为双链RNA分子的二级结构。双链RNA通过小干扰RNA（siRNA）或microRNA（miRNA）途径指导产生RNA的原始基因组位置的从头DNA甲基化。这种机制被认为在细胞防御 RNA病毒和或细胞防御中很重要转座子，这两种转座子通常形成可以对宿主基因组具有诱变性的双链RNA。通过甲基化它们的基因组位置，通过一种目前尚不清楚的机制，它们被关闭并且不再在细胞中活跃，保护基因组免受其诱变效应。

3 动物疾病中的甲基化

3.1 癌症中的甲基化

在癌症等多种疾病病程中，CpG岛（基因启动子）的过甲基化会沉默转录并通过分裂遗传至子细胞。目前，许多人认为在癌症发生发展中DNA甲基化是分成重要的一环。通常情况下，由于存在染色体具不稳定和印记丢失的情况，导致较早出现低甲基化，另外，基因沉默，如致癌基因抑制因子，则会影响与启动子有关的高甲基化，这是表观遗传治疗的可能的靶标[4]。在癌症病程中有数以百计的基因会被激活或者沉默，除基因突变外，大部本分基因的沉默由DNA甲基化状态的改变所致。DNA甲基化引起癌症沉默通常发生在多个CpG位点在CpG岛存在于所述启动子的蛋白质编码基因。micRNA表达的变化也是癌症中激活和沉默基因的原因，改变的micRNA表达通过控制micRNA转录的启动子中CpG岛中CpG位点的超低甲基化而发生。

3.2

诸如DNA甲基化的表观遗传修饰已涉及心血管疾病，包括动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化的动物模型中，血管组织以及诸如单核血细胞的血细胞表现出具有基因特异性高甲基化区域的整体低甲基化。DNA甲基化多态性可以用作动脉粥样硬化的早期生物标志物，因为它们在观察到病变之前存在，这可以提供检测和风险预防的早期工具。

靶向DNA甲基化多态性的两种细胞类型是单核细胞和淋巴细胞，其经历总体低甲基化。这种全球性低甲基化背后提出的机制之一是同型半胱氨酸水平升高导致高同型半胱氨酸血症，这是已知的心血管疾病危险因素。同型半胱氨酸的高血浆水平抑制DNA甲基转移酶，其导致低甲基化。DNA的低甲基化影响改变平滑肌细胞增殖，引起内皮细胞功能障碍和增加炎症介质的基因，所有这些都是形成动脉粥样硬化病变的关键。高水平的同型半胱氨酸也导致雌激素受体启动子区CpG岛的高甲基化α（ERα）基因导致其下调。

4 DNA甲基转移酶

在哺乳动物细胞中，主要发生DNA甲基化的位置为CpG二核苷酸的C5，并且通过两大类酶活性进行 - 维持甲基化和从头甲基化。维持甲基化活性对于在每个细胞DNA复制周期后保持DNA甲基化是必需的。如果没有DNA甲基转移酶（DNMT），复制机制本身就会产生未甲基化的子链，并且随着时间的推移会导致被动去甲基化。DNMT1是建议的维持甲基转移酶，其负责在DNA复制期间将DNA甲基化模式复制到子链。由于DNMT1活性需要在哺乳动物细胞中发育，因此缺失DNMT1两个拷贝的小鼠模型在大约第9天是胚胎致死的。据认为，DNMT3a和DNMT3b是在发育早期建立DNA甲基化模式的从头甲基转移酶。DNMT3L是与其他DNMT3同源但不具有催化活性的蛋白质。相反，DNMT3L通过增加其与DNA结合并刺激其活性的能力来辅助从头甲基转移酶。小鼠和大鼠具有名为DNMT3C 的第三种功能性从头甲基转移酶，其在Muroidea啮齿动物的共同祖先中通过串联重复进化为Dnmt3b的旁系同源物。DNMT3C在早期精子发生过程中催化转座因子启动子的甲基化，这种活动对于它们的表观遗传抑制和雄性生育能力是必不可少的[5.6]。由于许多肿瘤抑制基因在致癌过程中被DNA甲基化沉默，因此已经尝试通过抑制DNMT来重新表达这些基因。5-Aza-2-脱氧胞苷（地西他滨）是一种核苷类似物，通过阻止DNA消除催化步骤将它们捕获在DNA上的共价复合物中来抑制DNMT，从而导致酶的降解。然而，为了使地西他滨具有活性，必须将其掺入基因组中如果细胞没有死亡，细胞可以导致子细胞发生突变。此外，地西他滨对骨髓有毒，这限制了其治疗窗口的大小。这些缺陷导致反义RNA疗法的发展，通过降解其mRNA并阻止其翻译来靶向DNMT。然而，目前还不清楚单独靶向DNMT1是否足以重新激活DNA甲基化沉默的肿瘤抑制基因。

5 差异甲基化区域（DMRs）

差异甲基化区域是多个样品（组织，细胞，个体或其他）中具有不同甲基化状态的基因组区域，被认为是参与基因转录调节的可能功能区域。多组织（T-DMR）中DMR的鉴定提供了对人组织之间的表观遗传差异的全面调查。例如，这些甲基化的区域所特有的特定组织允许个人组织类型之间进行区分，诸如精液和阴道液。Lee等人目前的研究表明，DACT1和USP49通过检测T-DMR来確定精液[7]。事实证明，使用T-DMR可以识别犯罪现场发现的各种体液。法医领域的研究人员目前正在寻找基因中的新型T-DMR，用作法医DNA分析中的标记。癌症和正常样本（C-DMR）之间的DMR证明了癌症中的异常甲基化。众所周知，DNA甲基化与细胞的分化和增殖相关。

QDMR（定量差异甲基化区域）是量化甲基化差异的定量方法，并通过调整香农熵从全基因组甲基化谱中鉴定DMR。QDMR的无平台和无物种性质使其可能适用于各种甲基化数据。该方法为表观遗传调控中涉及的功能区的高通量鉴定提供了有效的工具。QDMR可用作量化甲基化差异和识别多个样品中DMR的有效工具。

6 DNA甲基化的应用

6.1 DNA甲基化标记

目前认为DNA甲基化标记--在特定生物状态下具有特定甲基化模式的基因组区域，例如组织，细胞类型，个体--可能作为功能区参与调控基因转录。具有相同基因组的各类人类细胞却有着不同甲基化组。要准确理解确定细胞命运的复杂调控机制系统，鉴定和特性描述跨类型细胞的甲基化标记尤其关键。刘洪波等提出了一种基于熵的框架（SMART）。将整个基因组亚硫酸氢盐测序甲基化组件整合到42个人体组织/细胞中，并鉴定了757，887个基因组区段。其中75%左右的片段在所有类型的细胞中表达均一甲基化，另外25%中，他们使用统计学方法鉴定了在少数细胞类型中特异性低/高甲基化的细胞类型特异性低/高甲基化标记，并呈现了人甲基化标记的图谱。通过深入分析可知，细胞类型特异性低甲基化标记通过H3K27ac富集和细胞类型特异性方式的转录因子结合位点。特别的是，细胞类型特异性低甲基化标记与驱动细胞同一性基因表达的细胞类型特异性超增强剂相关。该框架为人类基因组的互补功能，以及不同类型细胞特异性低甲基化的关键功能和特征均提供了有力的解释。

6.2 识别和检测体液

DNA甲基化允许在一次测定中分析几种组织以及使用提取的DNA鉴定少量体液。通常，DNA甲基化的两种方法是甲基化敏感性限制酶或用钠处理。亚硫酸氢盐。甲基化敏感的限制酶通过裂解特定的CpG，胞嘧啶和鸟嘌呤仅由一个磷酸基团分离，识别位点时所述CpG甲基化的工作。相反，该过程中甲基化的胞嘧啶保持甲基化，而未甲基化的胞嘧啶则被转化为尿嘧啶，。特别是，甲基化谱可以提供关于何时或如何在犯罪现场留下体液，识别体液类型，以及肇事者的年龄，性别和表型特征的大致信息。在识别和检测体液时，DNA甲基化提供了相对较好的灵敏度。在一项研究中，只需要10纳克的样本来确定成功的结果。

7 展望

DNA甲基化雖然不会改变DNA序列，仅修饰其表观遗传，但仍然在调控基因表达时起到关键作用。在各种表观遗传学现象中，DNA甲基化虽然是最早被发现并且研究相对成熟的一种，但就目前而言，其机理机制仍比较浅薄。相信随着表观遗传编辑、高通量测序及结构分析等技术的出现和发展，对DNA甲基化机制的研究也将登上更高的台阶，这将使其在医学领域中的运用更加深入、广泛，找到疾病相对应的DNA甲基化元件对各类疾病的诊断治疗及预后检测都有极大的帮助。

参考文献：

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