曙红探针光度法检测鸡肉与鸡蛋中残留恩诺沙星

唐志华，熊海涛，解萌

1(陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中，723001) 2(陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中，723001)

恩诺沙星(Enrofloxacin)又称乙基环丙沙基，是第三代喹诺酮类抗生素。作为一种广谱类抗菌活性药物，其对支原体、革兰氏阳性或阴性菌等有很好的杀灭效果，被广泛应用于畜牧及水产养殖等领域[1]。但是长期且过度使用会使其残留在牲畜及水产品中，进而在食用的人体内产生耐药性或致癌风险[2]。因此，对牲畜及水产品中恩诺沙星含量的准确检测就显得非常重要。目前，恩诺沙星的检测方法主要有高效液相色谱法[3-5]、毛细血管电泳法[6-7]、荧光光度法[8-9]、化学发光分析法/化学发光免疫法[10-13]、酶联免疫(ELISA)法[14-15]及电化学分析法[16-18]等。这些分析方法存在很多问题，比如，高效液相色谱法与毛细血管电泳法具有较高的准确度，但仪器昂贵，分析灵敏度低；荧光光度法与化学发光法虽然具有较高的灵敏度，但是其需要特殊试剂且方法的选择性较差；而酶联免疫法,制备的抗体与多种残留药物进行反应，不宜作为单一检测方法,仅适用于对大量样品的快速筛选与检测;电化学分析法通常需对电极界面进行修饰，导致检测过程费时，且分析的重现性也较差。

探针分光光度法(又称荷移光度法)主要是基于染料分子与一些特定有机小分子在某种反应介质中相互作用后形成新型离子缔合物，致使原有染料分子溶液的紫外-可见吸收光谱及吸光度均发生显著改变，从而实现对有机小分子进行灵敏检测。其中曙红是近些年探针光度法中应用较为广泛的染料分子之一。如江虹等[19]利用甲砜霉素和曙红在酸性条件下反应生成的缔合物会使体系的吸光度变大，从而建立了一种简便且快速检测甲砜霉素的分光光度法，检出限低至0.095 mg/L。而曾岗等[20]研究发现，在酸性介质中曙红与盐酸普罗帕酮能形成1∶1型离子缔合物，据此对盐酸普罗帕酮进行了灵敏检测。另外，李俊波等[21]利用曙红与长春瑞滨在强酸性介质下形成1∶2型离子缔合物而发生褪色反应，据此建立了一种探针光度法测定长春瑞滨的新方法，线性范围在0.25～15 μg/mL之间。但到目前为止，利用曙红探针光度法灵敏测定恩诺沙星的文献尚无报道。

本文依据在酸性介质中曙红与少量恩诺沙星相互作用后能形成一种新型离子缔合物(使反应体系的吸收光谱发生变化)，据此建立一种准确且灵敏地检测恩诺沙星的光度分析法。该方法能为肉类食品中恩诺沙星含量地测定提供一种参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

TU-1900双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平，上海奥斯仪器有限公司；恒温水浴锅，江苏省金坛市金祥龙电子有限公司；800型离心机，上海手术机械厂；pHS-3C精密酸度计，上海大普仪器有限公司。

恩诺沙星纯品(纯度99.7%)，北京索莱宝科技有限公司；NaOH(0.1 mol/L)、曙红(0.40 mmol/L)及BaCl2，国药集团化学试剂有限公司；CaCl2、MgCl2及CuSO4，成都市科隆化工试剂厂公司；二氯甲烷、甲醇、葡萄糖、蔗糖及淀粉，天津科密欧化学试剂有限公司；苏氨酸、甘氨酸及组氨酸，北京莱耀生物科技有限公司；0.1 mol/L盐酸溶液；0.01 mol/L硫酸溶液；1.0 mol/L醋酸溶液。

恩诺沙星储备液(1.0 mmol/L)的配制：准确称取0.359 4 g恩诺沙星纯品，先使用3.0 mL NaOH(0.1 mol/L)进行溶解，再用HCl调节至中性，并转移至100 mL容量瓶中,并定容于100 mL，摇匀待用；使用时用高纯水稀释至所需浓度。

所用试剂均为分析纯，实验用水均为高纯水。

鸡肉与鸡蛋，汉中汉台区水产批发市场。

1.2 样品的处理

取洗净且在研钵中研碎的鸡肉5.0 g，加入5.0 g无水Na2SO4继续研磨均匀。然后，放入10 mL离心管中，加入二氯甲烷4 mL，高速匀浆3 min，再离心6 min，移取上清液。把剩下的残渣再重新提取1遍，将2次的上清液合并，再用HAc-NaAc(pH 5.0)缓冲液稀释至10 mL。

将鸡蛋搅匀，放在253 K冰箱中保存，取适量放在10 mL离心管中，加入6 mL二氯甲烷提取剂，高速匀浆3 min,离心6 min，操作同上。

1.3 实验方法

在25 mL比色管中，依次加入适量曙红及恩诺沙星标准系列溶液(或样品溶液)，再用一定浓度的盐酸稀释至刻度线，摇匀，室温下放置4 min，以缓冲溶液作为参比溶液，在波长为520 nm处测定体系的吸光度，以吸光度A对恩诺沙星浓度作图，进而检测样品中恩诺沙星含量。

2 结果与分析

2.1 不同体系吸收光谱的研究

按照实验方法配制不同体系的溶液，以0.01 mol/L HCl为参比溶液,在波长200～750 nm范围进行光谱扫描(见图1)。恩诺沙星在271 nm处有一强吸收峰，而在可见光区几乎没有吸收；另外，曙红溶液的最大吸收波长在514 nm处，而同浓度的曙红溶液与一定浓度的恩诺沙星反应后，体系的最大吸收波长红移至520 nm处，且吸收强度明显降低。这说明曙红与恩诺沙星相混合后，会有新复合物生成。进一步研究发现(图2)，随着恩诺沙星浓度依次增大，二者混合体系在520 nm处的吸光值逐渐下降。因此，可以在520 nm波长处对恩诺沙星进行定量分析。

a-1.0×10-5 mol/L曙红; b-1.0×10-5 mol/L曙红+5.0 μg/mL恩诺沙星;c-5.0 μg/mL恩诺沙星

图1 不同体系的吸收光谱图

Fig.1 Absorption spectra of the different systems

图2 不同质量浓度的恩诺沙星存在时反应体系的的吸收光谱

Fig.2 Absorption spectra of the selecting system in the presence of different enrofloxacin concentrations

2.2 反应机理探讨

已有文献报道[21-22]，在pH 2.5的酸性介质中，曙红主要以阴离子(带2个负电荷)形式存在。而恩诺沙星分子中有3个叔胺(R3N)单元，会在强酸性介质中发生质子化以形成铵盐(R3NH+)，结果使恩诺沙星分子具有正电荷特性。因此，当一定浓度的曙红与恩诺沙星溶液相混合后，通过二者之间的静电与疏水作用生成一种离子缔合物。为了进一步探讨该离子缔合物的组成，本实验采用了摩尔比法。结果表明，随着曙红溶液浓度的增加，吸光值逐渐越大，当二者摩尔比增大到1以后，吸光度不再增加，说明离子缔合物已经反应完全，即，曙红与恩诺沙星形成的缔合物组成比为1∶1(图3)。

图3 曙红与恩诺沙星溶液摩尔比对吸光度的影响

Fig.3 Effect of the molar ratio of eosin to enrofloacxin on the absorbance

2.3 实验条件选择

2.3.1 反应介质pH值的选择

固定曙红与恩诺沙星溶液浓度不变，考察了不同pH反应介质中体系的吸光度。从图4可以看出，随着pH值的增大，吸光度呈现先增大后减小的趋势，当反应介质的pH值控制在2.7附近时，体系的吸光度最大。这可能是由于在强酸性介质中曙红与恩诺沙星均容易发生质子化，而在较高的pH值反应介质中，恩诺沙星的质子化程度变弱，即反应介质的pH值过低或过高时均会使曙红与恩诺沙星缔合的趋势变弱。因此，实验选择反应介质的最佳pH值为2.7。

图4 pH值对吸光度的影响

Fig.4 Effect of pH value on the absorbance

2.3.2 曙红浓度的选择

固定最适pH值不变，恩诺沙星质量浓度为0.5 μg/mL，本实验测定了曙红浓度在0.5×10-5～1.0×10-4mol/L范围内体系的吸光度(如图5所示)。结果表明，随着曙红浓度的增大，体系吸光度逐渐增大，但当曙红浓度超过2.5×10-5mol/L后，体系吸光度则会逐渐下降。这可能是由于作为体系的探针——曙红，其较低的浓度不利于体系完全反应，而过高的浓度则会引起体系自吸收程度增强。所以，曙红的最适浓度为2.5×10-5mol/L。

图5 曙红溶液浓度对吸光度的影响

Fig.5 Effect of eosin concentration on the absorbance

2.3.3 反应时间的选择

保持曙红浓度、pH值及恩诺沙星浓度不变，对体系反应时间分别在2、4、8、10及15 min时的吸光度进行测定。从图6可以看出，刚开始随着反应时间的延长，体系吸光度逐渐增大，超过4 min后，体系吸光度无明显变化。这说明在选定的实验条件下，曙红与恩诺沙星能在4 min内反应完全。因此，实验选择最佳反应时间为4 min。

图6 反应时间对吸光度的影响

Fig.6 Effect of reaction time on the absorbance

2.3.4 反应温度的选择

在其他条件不变的情况下，实验考察了不同反应温度对反应体系吸光度的影响。图7显示，在20～80 ℃范围内，随着反应温度的升高，体系的吸光度逐渐下降。这可能是由于随着反应温度的增大，曙红与恩诺沙星相结合而生成离子缔合物的稳定性减弱所致。故实验选择在近室温(20 ℃)条件下进行研究。

图7 反应温度对吸光的影响

Fig.7 Effect of reaction temperature on the absorbance

2.4 标准曲线

在优化的实验条件下，恩诺沙星浓度分别在0.08～2.0 μg/mL与2.0～10.0 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其线性回归方程分别为A=0.150 9C+1.245 8，A=0.008 9C+1.520 8；相关系数分别为0.996 2和0.996 9。按IUPAC建议，估算得方法检出限为0.05 μg/mL。对浓度为1.0 μg/mL恩诺沙星进行8次平行测定，其相对标准偏差(RSD)不大于5%。

2.5 共存物的影响结果

2.6 样品分析

各取1.2样品处理液1.0 mL，按照1.3实验方法对鸡肉与鸡蛋中恩诺沙星含量进行测定，并做加标回收实验。从表1与表2可见,鸡肉与鸡蛋中恩诺沙星的含量分别为1.06 μg/mL和0.36 μg/mL，而平均回收率则分别为93.61%和92.17%，相对标准偏差(RSD)均不大于5.1%。这说明建立的方法具有较高的准确度和精密度。

表1 鸡肉中恩诺沙星含量分析及回收率实验结果(n=3)

表2 鸡蛋中恩诺沙星含量分析及回收率实验(n=3)

3 结论

本实验利用酸性介质中恩诺沙星与曙红能形成一种离子缔合物而使曙红的吸收波长发生红移，且随着恩诺沙星浓度增大吸光度逐渐减小，由此建立了一种测定恩诺沙星含量的新方法。该方法具有操作简便、快速、试剂廉价、准确且灵敏度较高等特点，有望作为一种恩诺沙星残留的快速检测方法而应用于食品安全监管领域。