副干酪乳杆菌L1的安全性及益生性评价

田 原,季子非,郭浩南,冯琳琳,许云贺,张莉力

(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)

乳酸菌(LAB)广泛存在于自然界中,是参与不同类型食品发酵的主要微生物类群之一。它们以其潜在的健康和营养益处而闻名,因此被认为是“具有益生性能的微生物”或“当摄入足够量的活的乳酸菌,可赋予宿主健康等益处”[1]。近年来,人们逐渐关注乳酸菌并了解到其对人体的好处。它们能够对人体肠道的综合性疾病有良好的改善和辅助治疗作用,尤其对病毒性、过敏性腹泻和便秘有较佳的疗效[2-3]。但是,乳酸菌的菌株种类千差万别,所以在产酸、耐热、产生风味物质以及胃肠道中的耐受力、黏附肠壁力、临床效果和对宿主健康等方面的应用程度和有益程度上出现天壤之别[4]。大量文献证明,使用乳酸菌发酵的产品是可行的、安全的,但是在少量临床的病例和科学研究中也发现,在部分心内膜炎患者、败血症、肝脓肿和尿路感染的病人体内分离出乳酸菌[5-6],进而乳酸菌的应用究竟是否存在安全性问题成为全球关注的热点。因此,对食品乳酸菌株进行安全性和益生性评价是非常必要的。

分离于地瓜自然发酵酸浆中的优势乳酸菌副干酪乳杆菌L1,是来自锦州医科大学食品科学与工程学院食品微生物实验室的自产植物源乳酸菌[7],该菌在高淀粉培养基质中快速增殖(在地瓜汁培养基中培养24 h活菌数能达到1.79×1012CFU/mL),高效产酸(在地瓜汁培养基中培养24 h,pH下降到3.4左右),具有黏附淀粉,快速沉降地瓜淀粉的作用,用于制作地瓜淀粉絮凝剂,工业生产地瓜粉丝等[8]。本实验通过耐药性实验、有害代谢产物实验及动物实验,确定该株菌是否具有安全性能,通过对外界环境耐受性、生理功能特性及体外细胞黏附实验,确定该株菌是否具有益生性能,为副干酪乳杆菌L1应用于实际生产生活奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副干酪乳杆菌L1、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 均来自于锦州医科大学食品科学与工程学院食品微生物实验室;健康昆明SPF雄性小鼠 体重18 g左右,来源于锦州医科大学SPF级动物培养中心;Caco-2细胞 锦州医科大学生命科学院;葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、氯化钠、可溶性淀粉、对二甲氨基苯甲醛、浓盐酸、95%乙醇、乙醚、硝酸钾、碘化钾、溴甲粉紫、液体石蜡、甲苯 天津市风船化学试剂科技有限公司;酵母膏、蛋白胨、琼脂糖、乳糖 北京奥博星生物技术有限公司;L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-鸟氨酸 Sigma公司;Tris base、溶菌酶、硼酸、Na2EDTA·2H2O、溴化乙锭、1 kbp DNA marker、质粒提取试剂盒 沈阳天根生化试剂责任有限公司;药敏纸片 杭州微生物试剂有限公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;0.25%胰酶溶液、双抗液 Gibco公司;磷酸盐缓冲盐水(PBS)、细胞高糖培养液(DMEM) HyClone公司;TritonX-100 合肥博美生物科技有限公司;地瓜汁液体培养基[7-8]用来培养副干酪乳杆菌L1;牛肉膏蛋白胨培养基、氨基酸脱羧酶实验培养基、硝酸盐培养基、蛋白胨水培养基 为微生物国标配制方法;哥伦比亚血琼脂平板 无锡赛维商务有限公司。

HR/T20MM立式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DYY-4C型电泳仪电源 北京市六一仪器厂;SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;2F-104凝胶成像分析系统 金坛市盛蓝仪器制造有限公司;SCAN300型全自动菌落计数器 Interscience;倒置显微镜DP73 Olympus公司;CO2恒温培养箱CHP-160常州智博瑞仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 副干酪乳杆菌L1菌液的制备 将副干酪乳杆菌L1接种于预先配制好并灭菌后的地瓜汁液体培养基中,接种量为10%(v/v),30 ℃恒温培养24 h,活化三代后待用。

1.2.2 Caco-2细胞培养 配制完全培养基,每10 mL DMEM高糖培养基加2 mL胎牛血清加0.1 mL双抗液。将冻存的Caco-2细胞从液氮中取出,立即放入37 ℃水浴锅中快速融化,用无菌移液枪将融化后的细胞悬液2 mL移至15 mL离心管中,向离心管中加入4 mL 37 ℃预热的完全培养基,混匀,1000 r/min离心4 min,弃去上清,加入10 mL完全培养基,将混匀后的细胞悬浮液移至细胞培养瓶中,置于95%湿度,5% CO2培养箱,37 ℃下恒温培养。当细胞贴壁80%左右进行细胞换液,吸出旧的培养基,用无菌PBS清洗一次,加入新的完全培养基,根据细胞生长状态,每1～2 d换液一次。当细胞80%～90%汇合时进行细胞传代,弃去旧的培养基,用无菌PBS清洗两次,加入1 mL预热的0.25%胰酶消化5 min,加入1 mL胎牛血清终止消化,将混合液体倒入离心管,1500 r/min离心4 min,弃去上清液,加入3 mL无菌PBS重复离心,弃上清,加入完全培养基,吹打混匀细胞,按1∶2的比例传代培养[9]。

1.2.3 安全性评价

1.2.3.1 药敏实验 采用K-B(药敏纸片琼脂扩散法),用无菌生理盐水将副干酪乳杆菌L1稀释成浓度为1.0×109CFU/mL的菌悬液,取0.1 mL均匀涂布于地瓜汁固体培养基表面(固体培养基为液体培养基加2%的琼脂),放置30 min以上待干燥后,用无菌镊子夹取药敏纸片平贴在涂好细菌的琼脂表面,每个平板贴2种药敏纸片。所用的药敏纸片分别为:红霉素、链霉素、卡那霉素、万古霉素、青霉素、诺氟沙星、阿奇霉素和四环素。将贴好药敏纸片的平板放置30 min以上,然后倒置平板30 ℃培养48 h,用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈大小[1,10-11]。

1.2.3.2 质粒提取实验 取2 mL活化后的副干酪乳杆菌L1菌悬液,使用质粒提取试剂盒和高效溶菌酶,提取L1的质粒[12-13]。配制1%浓度的琼脂糖凝胶,温度降到55 ℃左右时,加入EB摇匀,制胶板。取5 μL提取液与1 μL 6×Loading buffer混匀,点样于琼脂糖凝胶孔道中,电泳液为1×TBE溶液,电压设定100 V,电流设定60 A,工作时间90 min。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于图像记录分析系统中,在254 nm紫外灯照射下,观察是否有电泳条带。

1.2.3.3 氨基酸脱羧酶检测实验 在1000 mL蒸馏水中加入蛋白胨5 g,酵母膏3 g,葡萄糖1 g,1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1 mL,调节pH为6.8,将酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸五种氨基酸分别按0.5%的接种量加入到培养基中,分为五组氨基酸培养基,将活化后的副干酪乳杆菌L1菌悬液按照10%接种量(v/v)分别接入到灭菌后的五组培养基中,制备五组实验组(培养基加氨基酸接菌)和对照组(培养基不加氨基酸接菌),30 ℃培养24 h和48 h,观察培养基颜色变化[1,14]。

1.2.3.4 硝酸盐还原酶检测实验 在1000 mL的地瓜汁液体培养基中加入蛋白胨5 g,硝酸钾0.2 g,加热溶解,调节pH为7.4,配制成硝酸盐培养基。将活化后的副干酪乳杆菌L1菌悬液按照10%接种量(v/v)接入到灭菌后的硝酸盐培养基中,制备实验组(接菌)和对照组(不接菌)。30 ℃培养48 h后,先滴加10滴5%的KI溶液,再滴加10滴5%的淀粉溶液,充分震荡混匀后观察培养基颜色变化[15]。

1.2.3.5 吲哚实验 将活化后的副干酪乳杆菌L1菌悬液按照10%接种量(v/v)接入到灭菌后的蛋白胨水培养基中,制备实验组(接菌)和对照组(不接菌),30 ℃培养48 h后取出,在培养基中加入2 mL乙醚,充分振荡,静置片刻,使乙醚浮于上层液面,此时沿管壁缓慢加入10滴吲哚试剂(切勿摇动),观察两层交界处颜色变化[11]。

1.2.3.6 溶血实验 在无菌条件下,用灭菌的接种环挑取活化后的副干酪乳杆菌L1菌悬液在血琼脂平板上划线,30 ℃倒置培养48 h后,观察菌落周围有无溶血圈,拍照记录反应现象。若在菌株菌落周围的琼脂显示绿色,为α-溶血;在菌落周围出现透明圈,为β-溶血;对溶血无作用或不溶血,为γ-溶血[16-17](用金黄色葡萄球菌作为阳性对照组进行比较)。

1.2.3.7 小鼠急性毒性实验 将24只小鼠随机分成实验组和对照组,每组12只。设置小鼠环境温度22 ℃,湿度60%,每日光照12 h,补足鼠粮和纯净水,适应性喂养3 d后进行实验,实验期间环境不变。调整活化后菌液浓度为1.0×1011CFU/mL,实验组每次灌胃0.2 mL菌悬液,对照组每次灌胃0.2 mL生理盐水,每天定时灌胃一次。喂养期间保证小鼠自由进食、进水,每天记录观察小鼠生命活动特征、体重等生理状态。每组随机选取4只,在喂养第7 d禁食、禁水,第8 d采用颈椎脱臼法处死解剖小鼠[18-19],观察其心、肝、脾、肺、肾器官变化并称量脏器质量,计算脏器指数,公式如下:

脏器指数=m1/m2

式(1)

式中:m1为脏器质量(g);m2为小鼠体重质量(g)。

1.2.3.8 30 d喂养实验 经过适应性喂养后的小鼠中,随机选取实验组和对照组各4只。饲喂情况同1.2.3.7,延长喂养时间至30 d,每天记录小鼠生命活动特征和体重状况。第31 d处死解剖小鼠后,观察其心、肝、脾、肺、肾器官变化并称取脏器质量,计算脏器指数,公式同1.2.3.7。

1.2.4 益生性评价

1.2.4.1 耐酸性 用稀盐酸调整地瓜汁液体培养基的pH至2.0、2.5、3.0、3.5,在115 ℃灭菌30 min后,冷却备用。以未经调整过的地瓜汁液体培养基(pH约为7.0)作为对照。将副干酪乳杆菌L1活化后转接至以上培养基中,接种量10%(v/v),置于30 ℃恒温培养箱中培养,分别在0、1、2、3 h处取样,采用平板菌落计数法测定样品中的菌体数量[17,20]。

1.2.4.2 胆汁盐耐受性 用0.4% NaOH调整地瓜汁液体培养基的pH至7.8,在上述培养基中加入牛胆盐(煮溶20 min完全溶解),配制含有质量浓度分别为0.03、0.30、0.50 g/100 mL的地瓜汁液体培养基,在115 ℃下灭菌30 min后备用。以不含牛胆盐的地瓜汁液体培养基作为对照。将活化后的副干酪乳杆菌L1转接至以上培养基中,接种量10%(v/v),置于30 ℃恒温培养箱中培养,分别在0、1、2、3、4 h处取样,采用平板菌落计数法测定样品中的菌体数量[21-22]。

1.2.4.3 耐高盐评价 配制含有不同浓度NaCl(1、2、3、4、5 g/100 mL)的地瓜汁液体培养基,115 ℃灭菌30 min后备用。以不含NaCl的地瓜汁液体培养基作为对照。将活化后的副干酪乳杆菌L1转接至以上培养基中,接种量10%(v/v),置于30 ℃恒温培养中,培养24 h取样,采用平板菌落计数法测定样品中的菌体数量[20]。

1.2.4.4 自聚集性 将活化后的副干酪乳杆菌L1在20 ℃下3000 r/m离心10 min,蒸馏水洗涤2次,再悬浮,用蒸馏水稀释,调整OD值在660 nm下为0.3(OD0)。在37 ℃孵育60 min后,再次测量660 nm下的OD值(OD60)[20]。自聚集计算公式:

自聚集(%)=[(OD0-OD60)/OD0]×100

式(2)

1.2.4.5 疏水性 测定细菌对甲苯类化合物的黏附性。取5 mL活化后的副干酪乳杆菌L1菌液在20 ℃下3000 r/min离心15 min,用蒸馏水洗涤两次,再悬浮于5 mL蒸馏水中,得到约108CFU/mL(OD560,A)。然后将4 mL悬浮液与1.2 mL甲苯接触。孵育10 min后,涡流2 min,使细菌悬浮液与二甲苯完全混合,水相OD(A0)在560 nm处测定[23]。疏水性计算公式:

H(%)=[(A-A0)/A]×100

式(3)

1.2.4.6 副干酪乳杆菌L1对Caco-2细胞的黏附观察 将Caco-2细胞接种于带有细胞爬片的六孔培养板中培养,每天换液至细胞铺满单层,黏附观察前最后一次换液换成无双抗的培养基。将预先活化好的副干酪乳杆菌L1菌悬液3000 r/m离心5 min,弃上清,无菌PBS洗一次,重复上述离心,弃上清,加入等量的DMEM制成菌悬液,每孔加入1 mL菌悬液,与Caco-2细胞共培养2 h。取出细胞爬片,用无菌PBS清洗三次,以除去未黏附的细菌,10%甲醛固定30 min,自然风干,结晶紫染色,显微镜下观察黏附情况,粗略计算每个Caco-2细胞黏附的细菌数[24]。

1.2.4.7 副干酪乳杆菌L1对Caco-2细胞的黏附计数 将Caco-2细胞接种于不含细胞爬片的六孔培养板中培养,细胞与细菌处理同上。共培养3 h后,弃去液体,用无菌PBS清洗孔板三次,以除去未黏附的细菌。之后每孔加入0.7 mL预热后的胰酶作用10 min,待细胞完全脱落,加入0.3 mL含有胎牛血清的培养基终止反应。再用TritonX-100裂解细胞5 min,将裂解后的混合液体梯度稀释,涂布在MRS琼脂平板上,30 ℃培养48 h后计数,每个梯度3个重复[1]。黏附率公式:

黏附率(%)=黏附细菌数/初始细菌数×100

式(4)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 副干酪乳杆菌L1安全性评价

2.1.1 耐药性评价实验结果 耐药性实验结果见表1,副干酪乳杆菌L1对常见8种抗生素中的红霉素和阿奇霉素表现为抗性,对青霉素敏感,其他5种抗生素均不敏感。一些抗生素的试验表明,乳酸菌不会受到使用这些抗生素治疗的影响,并且可能有助于维持抗生素治疗过程中肠道菌群的自然平衡[1]。

表1 耐药性实验检测结果Table 1 The results of resistance test

2.1.2 质粒提取实验结果 若是乳酸菌的耐药基因存在于可转移的质粒上,就容易导致乳酸菌上的耐药基因通过水平方式转移到人体基因组上,通过基因表达造成潜在危害[25-26]。琼脂糖凝胶电泳实验结果见图1,副干酪乳杆菌L1的3个平行样泳道上面均没有条带出现,说明副干酪乳杆菌L1没有质粒存在,这就说明该株菌的耐药基因是存在于乳酸菌自身基因组上,没有在质粒上,因此可初步判断该株菌是安全菌株。

图1 质粒提取电泳图Fig.1 Electrophoregram of plasmid extraction注:M:1 kb DNA Marker;1、2、3:副干酪乳杆菌L1。

2.1.3 有害代谢产物实验结果 有害代谢产物实验结果见图2。氨基酸脱羧酶实验中使用的氨基酸为酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸,经氨基酸脱羧酶作用后脱氨分别形成酪胺、腐胺、尸胺、组胺和精胺。而生物胺过量积累会引起人体副作用,如头痛、高血压、恶心和呕吐等症状[27]。在氨基酸脱羧酶活性检测实验结果中,对照组和五组实验组培养基变浑浊且为黄色,说明该菌在增殖过程中表现为阴性反应,即副干酪乳杆菌L1不产生氨基酸脱羧酶,对人体无害。

表2 有害代谢产物实验结果Table 2 Experimental results of harmful metabolites

硝酸盐还原酶会催化硝酸盐还原成亚硝酸盐,亚硝酸盐是一种剧毒强致癌物,一旦摄入后会对人体造成严重危害[28]。在硝酸盐还原酶检测实验结果中,对照组培养基无颜色变化,实验组培养基变浑浊且为淡黄色,说明该菌在增殖过程中表现为阴性反应,即副干酪乳杆菌L1不产生硝酸盐还原酶,对人体无害。

色氨酸是人体必须的氨基酸之一,有免疫、促进消化、调节蛋白质合成等功能。若菌株分解蛋白质中的色氨酸产生靛基质,会影响机体对色氨酸的吸收[11]。在吲哚实验结果中,实验组培养基变浑浊且乙醚层为无色,说明该菌在增殖过程中表现为阴性反应,即副干酪乳杆菌L1不产生色氨酸酶,不会影响色氨酸的代谢。

溶血现象是人体内一种不正常的现象[29],溶血素生产能力越强,红血球破坏越严重,溶血现象越严重,一旦人体被感染,会造成非常严重的败血症,是乳酸菌安全性评价的重要检测指标之一。实验结果见图2,副干酪乳杆菌L1在血平板上培养48 h后长出乳白色菌落且没有溶血圈,属于没有毒性的γ-溶血,说明该菌株不是致病菌,且无致病性,而金黄色葡萄球菌表现出β-溶血。

图2 溶血实验检测结果Fig.2 The results of hemolysis test注:a:副干酪乳杆菌L1;b:金黄色葡萄球菌。

2.1.4 小鼠急性毒性实验结果 动物实验是检测食品安全性最直接最有效的方法之一。根据《食品安全性毒理学评价程序》定义乳酸菌毒理学评价,可先进行第一阶段和第二阶段毒性实验,检测结果未观察到的最大有害作用剂量大于等于人体摄入量的100倍[30],并在短期喂养实验中没有发现明显的毒性作用,可综合其他实验结果,初步作出安全性评价。小鼠急性毒性实验期间,灌胃7 d内,未出现死亡,小鼠生命活动一切正常,饮食和饮水较稳定,鼠毛光洁白亮,排泄物状态正常,且小鼠体重随着喂养时间呈现增长趋势,与对照组相比,无显著性差异(p>0.05)(见表3)。第8 d解剖后,小鼠的心、肝、脾、肺、肾五种主要器官组织无病变,且通过脏器指数比较,副干酪乳杆菌L1组和生理盐水组的脏器指数无显著性差异(p>0.05，见表4),说明副干酪乳杆菌L1对小鼠无毒害作用。

表3 动物体重变化(g)Table 3 The weight change of animals(g)

表4 急性毒性实验脏器指数结果Table 4 The index results of acute toxicity organ

2.1.5 30 d喂养实验结果 小鼠亚慢性毒性实验期间,灌胃30 d内,未出现死亡,小鼠生命活动一切正常,饮食和饮水较稳定,鼠毛光洁白亮,排泄物状态正常,且小鼠体重随着喂养时间呈现增长趋势,与对照组无显著性差异(p>0.05，见表5)。第31 d解剖后,小鼠的心、肝、脾、肺、肾五种主要器官组织无病变,且通过脏器指数比较,副干酪乳杆菌L1组和生理盐水组的脏器指数无显著性差异(p>0.05)(见表6),说明副干酪乳杆菌L1对小鼠的生理活动及身体主要器官无有害影响。

表5 动物体重(g)变化Table 5 The weight(g)change of animals

表6 30 d喂养实验脏器指数结果Table 6 The index results of 30 d feeding experiment

2.2 副干酪乳杆菌L1益生性评价

2.2.1 环境耐受性评价

2.2.1.1 耐酸性实验结果 要发挥乳酸菌的益生性能,在到达肠道之前,乳酸菌首先必须在胃中存活,其中胃酸的分泌构成了大部分摄取微生物的主要防御机制。人胃中的pH在禁食期间为1,在餐后为4.5,食物消化可长达3 h[21]。如表7所示,不同酸性环境下,L1活菌数的变化趋势并不相同。在对照组培养基中,初始活菌数为107CFU/mL,培养1 h后,活菌数升了一个数量级,并且在实验的3 h中,活菌数在不断上升。在pH3.5的地瓜汁TJA培养基中培养3 h,副干酪乳杆菌L1的活菌数没有降低,反而呈上升趋势，pH为3.5时的上升趋势大于pH为3.0时的上升趋势，但二者差异均不显著(p>0.05),说明副干酪乳杆菌L1的生长对于pH3.5和3.0的酸性环境几乎不受影响。

表7 不同酸性环境下细菌存活数Table 7 Bacterial survival in different acidic environments

在pH2.5和2.0的环境下,L1的活菌数随着培养时间的增加略有降低,但差异不显著(p>0.05)。可以看出在培养过程中,L1的总体活菌数始终在107CFU/mL以上,能够满足益生菌在人体内发挥作用的浓度要求(一般为106～109CFU/mL)。由以上结果可见,副干酪乳杆菌L1对人体生理浓度范围内酸性变化有较好的耐受性。

2.2.1.2 胆汁盐耐受性实验结果 为了更好的发挥益生性能,乳酸菌同样要有良好的胆盐耐受性。由于小肠中胆盐的生理浓度介于5000～20000 μmol/L之间,食物在小肠中停留1～4 h,所以我们最高使用0.5 g/100 mL的胆盐浓度,相当于12255 μmol/L,并且测定了培养0～4 h的活菌数[16]。如表8,副干酪乳杆菌L1在对照组培养基中初始数量为107CFU/mL,培养1 h后,菌体数量上升了一个数量级,并且在实验的4 h中,活菌数不断上升。在含有0.03 g/100 mL胆盐的地瓜汁TJA培养基中,活菌数有少量的下降,但差异并不显著(p>0.05),并在培养2 h后有小幅度的上升趋势。在含0.3、0.5 g/100 mL胆盐的地瓜汁TJA培养基中作用1 h后,活菌数略有降低(p>0.05),但培养到3～4 h后,降低趋势逐渐平稳。可以看出在培养过程中,L1总体的活菌数始终在107CFU/mL以上,能够满足益生菌在人体内发挥作用的浓度要求(一般为106～109CFU/mL)。由此可见,副干酪乳杆菌L1对人体生理浓度范围内的胆盐有较好的耐受性。

表8 不同胆盐浓度下细菌存活数Table 8 Bacterial viability under different bile salt concentrations

2.2.1.3 耐高盐实验 乳酸菌摄入体内之后,同样需要耐受不同程度的渗透压,从而发挥有效作用。如图3,在地瓜汁TJA液体培养基中加入不同浓度的NaCl,副干酪乳杆菌L1在其中培养24 h后,活菌数与不含NaCl的初始数相比稍有降低(p>0.05),即使在NaCl浓度为5 g/100 mL时存活率仍高达97.2%,总体活菌数始终保持在1010CFU/mL以上。由此可见,副干酪乳杆菌L1具有较强的耐高盐能力,在胃肠道的高盐环境中能够有效地消除高渗透压所带来的不利影响,维持菌体渗透压的相对平衡。

图3 不同盐浓度下细菌数Fig.3 The number of bacteria under different salt concentration注:上标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

2.2.2 生理特性评价 自聚集是生物膜形成的一个重要特性,而乳酸菌生物膜通过保护胃肠道转运中的菌株,产生抗菌化合物和刺激免疫应答从而进行肠道定植[16],因此,自聚集性可反映细菌的黏附性能。如表9,在660 nm下,副干酪乳杆菌L1菌悬液孵育1 h的自聚集性为15.8%±1.2%,同样条件下任大勇[31]测定的阳性对照鼠李糖乳杆菌GG孵育2 h的自聚集性为33%;在Shekh等[16]测定的10株菌中,2株鼠李糖乳杆菌Fb和GG孵育2 h的自聚集性分别为14%和30%,其余8株植物乳杆菌孵育2 h的自聚集性在3%～20%之间,并且随着孵育时间的增加,自聚集能力会明显增加。而张俊娟[32]测定的15株乳酸杆菌中,在1～3 h的孵育时间得到自聚集性的平均值为15%～98%,菌株间差异较大。因此可以看出,副干酪乳杆菌L1具有一定的自聚集性,但相对较低。

Perez研究表明,可通过测定菌株疏水性的大小来推断其黏附能力的高低,疏水性在细菌发挥黏附作用和自聚集反应中均起到重要的作用,即疏水性高的菌株对肠上皮细胞的黏附作用也强,并且这种关联呈现一定的依赖性[33]。如表9,在560 nm下,副干酪乳杆菌L1菌悬液的疏水性为9.7%±0.8%;参考王娉婷[34]测定的阳性对照鼠李糖乳杆菌GG的疏水性24.37%,L1疏水性相对较低;Shekh等[16]测定的10株植物乳杆菌的疏水性为10%～37%,其中LGG疏水性为28%;对比张俊娟[32]测定的15株乳酸菌的疏水性,小于5%的占46.67%、在5%～20%之间的占33.33%、大于20%的占20.00%,可以看出L1具有一定的疏水性,但相对偏低。

表9 不同菌株自聚集性和疏水性比较Table 9 Comparison of self aggregation and hydrophobicity of different strains

细菌的疏水性源于菌体表面的非极性残基的相对分布,静电相互作用则与静电荷有关,自聚集能力也是菌体表面性质的一种外在反映[35],因此自聚集性和疏水性高可能对细菌的黏附能力有促进作用,但这只是高黏附性能的初筛指标,并不是黏附能力强的必要条件,所以副干酪乳杆菌L1的黏附能力还需进一步的测定去判断。

2.2.3 黏附性评价

2.2.3.1 黏附观察 Caco-2细胞在形态学上与人小肠上皮细胞相似,经培养后可形成极性的单层细胞,常被用于细菌体外黏附实验[36]。细菌黏附在肠道上皮细胞才能有效的定植于肠道,从而发挥益生性能。如图4,在油镜下观察副干酪乳杆菌L1黏附到Caco-2细胞的两个视野,可见每个细胞约黏附30个细菌,而在倒置显微镜400倍下只能看见细胞,细菌几乎观察不到。参考陈臣[35]测定阳性对照鼠李糖乳杆菌LGG对Caco-2细胞的黏附数为15,而L1黏附数约为30,可以看出L1黏附数高于LGG。

图4 副干酪乳杆菌L1对Caco-2细胞的黏附(1000×)Fig.4 Adhesion of Lactobacillus caseiL1 to Caco-2 cells(1000×)

2.2.3.2 黏附计数 经平板计数得出副干酪乳杆菌L1对Caco-2细胞黏附率为22.37%±1.44,参考Yeo等[17]测定的阳性对照鼠李糖乳杆菌LGG的黏附率为5.10%,由张莉[37]测定的LGG对Caco-2的黏附率为4.28%,可以看出L1的黏附率明显高于LGG。L1能较好的黏附并定植于人体肠道,从而发挥其益生作用。

3 结论

通过对副干酪乳杆菌L1的安全性评价可知,该菌在耐药性检测实验中,对常见的8种抗生素中对红霉素和阿奇霉素表现为抗性,对青霉素表现为敏感,其他均不敏感且不含质粒;在有害代谢产物检测实验中,实验结果均为阴性,且为无毒的γ-溶血;在动物实验中,体重和脏器指数均与对照组无显著性差异(p>0.05),各脏器和生理状态也很健康。由益生性评价可知,该菌对外界环境中的酸性、胆盐及高渗透压耐受性良好,也体现了一定的自聚集性和疏水性,对体外Caco-2细胞能有较好的黏附特性。因此,副干酪乳杆菌L1表现了良好的安全性和益生性,为实际生产应用提供了理论基础。