葛根水提液及葛根发酵液的体外抗氧化及抗衰老功效评价

吴 迪,刘平平,李 萌,*,王昌涛,2,赵 丹,张佳婵

(1.北京工商大学理学院，北京市植物资源研究开发重点实验室,北京 100048; 2.北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048)

葛根(PuerariaDC.)又名葛藤、葛麻叶、甜葛藤、粉葛藤等[1]。葛根含有的活性成分为总黄酮,另外还含有少量的生物碱等。其中,葛根总黄酮中含有的异黄酮成分,是葛根的主要活性成分[2-4]。研究表明,葛根异黄酮是一种天然的抗氧化剂,具有较强的抗氧化作用[5]。此外,葛根素具有较强的抗缺氧和抗氧化作用[6]。西方的一些发达国家多在葛根素的提取及药效方面进行研究,着重研究葛根黄酮的体内体外抗氧化活性和雌激素效应[7]。葛根的药理作用主要有:对肝脏的保护作用、对基因表达的影响、抗氧化作用、辐射防护作用[8]。

在葛根的研究中,对其进行微生物发酵并对其进行抗衰老功效评价较少,故本实验主要利用微生物发酵法对葛根中的有效成分进行提取,并与葛根水提液一同进行抗氧化及抗衰老功效测定,从而评价葛根水提液及葛根发酵液是否有潜在的抗衰老功效,为其在食品药品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粉葛片 云南白药集团股份有限公司中药饮片分公司;人皮肤成纤维细胞 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;黄酒酵母 北京市食品酿造研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、胰酶(0.25% EDTA) 美国Sigma Aldrich公司;DMEM培养基、新生牛血清、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、青霉素(1×105U/L)、链霉素(100 mg/L) 美国Gibco公司;人Ⅰ型胶原(COLI)酶联免疫检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒 碧云天生物技术有限公司;人基质金属蛋白酶(MMP-1)酶联免疫试剂盒 美国CUSABIO公司;MTT 北京拜尔迪生物技术有限公司;其余无机试剂 均为国产分析纯。

BS2202S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DSHZ-300恒温水浴振荡器 江苏省太仓市实验设备厂;CO2恒温培养箱 美国Thermo公司;高速台式冷冻离心机 德国Sigma公司;Multiskan酶标仪 赛默费世尔(上海)仪器有限公司;UV-1240 紫外分光光度计 日本岛津公司;YJ-2450医用超净工作台 苏州净化设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根水提液及葛根发酵液的制备 葛根水提液的制备:选用50目葛根粉20 g,按照料液比为1∶15 (g/mL,下同)加入去离子水300 mL,70 ℃水浴摇床中提取3 h,冷却后4900 r/min离心10 min,取上清液待测,过膜备用;葛根发酵液的制备:选用50目葛根粉20 g,按照料液比为1∶15,加入去离子水,高温高压灭菌后,接入5%的黄酒酵母扩培菌液,置于培养箱中28 ℃,180 r/min培养48 h,再次灭菌冷却后4000 r/min离心10 min,取上清液,过膜备用。

1.2.2 主要活性成分的测定 吸取1 mL的葛根水提液及发酵液,分别测定其黄酮含量及总糖含量。

1.2.2.1 黄酮含量测定 按照硝酸铝-亚硝酸钠比色法[25]测定。称取5 mg干燥恒重的芦丁标准品,用少量60%的乙醇搅拌溶解,后转移到50 mL容量瓶中并定容,摇匀,得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液。分别吸取芦丁标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于六支10 mL比色管中,各加入30%乙醇溶液使比色管内均达到5 mL。后各取出1 mL于试管中,精确加入5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,摇匀放置6 min。随后加入4 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,摇匀放置15 min,以第1管为空白于510 nm波长下测定吸光度,以吸光度对标准品含量作图,绘制标准曲线。样品测定时,取葛根水提液、葛根发酵液2 mL,加入30%乙醇溶液使比色管内达到5 mL,取1 mL样品加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,摇匀放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,摇匀放置6 min。加入4 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,摇匀放置15 min,在510 nm下测定吸光度,用溶剂作为空白。所得黄酮标准曲线为y=0.3715x+0.0039(R2=0.99976)。

黄酮得率(%)=发酵液中黄酮含量×水提液(发酵液)体积×100/葛根粉质量

式(1)

1.2.2.2 总糖含量测定 按照苯酚-硫酸法[26]测定。准确称取无水葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容,得到1 mg/mL葡萄糖溶液。苯酚10 g加水190 mL得5%苯酚溶液于棕色瓶中。量取1 mg/mL葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中定容,准确吸取该系列溶液各2 mL,分别置于试管中,进行比色反应。取稀释200倍的葛根水提液、葛根发酵液2 mL于试管中,以2.0 mL去离子水做空白对照,加1 mL 5%苯酚溶液混匀。加入5.0 mL浓硫酸,混匀5 min后,沸水浴1 h。取出冷却后至室温,在490 nm处测吸光度。所得总糖的标准曲线为y=12.277x+0.0143(R2=0.998)。

总糖得率(%)=发酵液中总糖含量×水提液(发酵液)体积×100/葛根粉质量

式(2)

1.2.3 对DPPH自由基清除作用的测定 参考文献[27-28]中的方法。将提取液与发酵液用去离子水稀释五个梯度作为待测液,取等体积的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀为A1管;取等体积的无水乙醇与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀为A2管;取等体积的无水乙醇与待测液混匀为A3管。反应30 min后,在517 nm下利用测A1、A2、A3管吸光度。DPPH自由基清除率计算公式[29-33]如下。

清除率(%)=[(A2+A3)-A1]×100/A2

式(3)

1.2.4 细胞培养 将人皮肤成纤维细胞培养于含10%新生牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中,以0.05 g/100 mL胰酶消化传代。将处于对数生长期的细胞接种于细胞培养板上进行培养,37 ℃5% CO2培养12 h。

1.2.5 细胞活力的测定 参考文献[34]的方法,取对数生长期人皮肤成纤维细胞以0.05%胰酶消化、细胞培养液制备成单细胞悬液,细胞浓度为1×105/mL,接种于96孔细胞培养板中,每孔100 μL,过夜后,每孔加入100 μL含不同质量浓度样品溶液或无样品DMEM培养基,实验设置调零组(DMEM)、细胞对照组(细胞+DMEM)、样品组(细胞+不同浓度样品溶液)。样品组葛根水提液、葛根发酵液的样品溶液终质量浓度均设定为0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL,每组5个平行孔。37 ℃、5% CO2条件下培养24、48、72 h。常规方法加入5 mg/mL噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)溶液与DMEM培养液混合溶液(体积比1∶5)100 μL处理4 h,150 μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解,37 ℃孵育10 min,测定490 nm波长处吸光度。细胞活力按下式计算。

式(4)

1.2.6 人皮肤成纤维过氧化氢酶活力的测定 按照过氧化氢酶检测试剂盒说明书进行样品测定。标准曲线的绘制:取0.0、12.5、25.0、50.0、75.0 μL新鲜配制的5 mmol/L H2O2溶液,分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最终体积为100 μL。分别取4 μL,加入96孔板的孔内。加入200 μL显色工作液。25 ℃孵育15 min,测定520 nm波长处吸光度A,得到标准曲线为y=39.631x-0.0003,R2=0.99845。分别取3 μL经葛根水提液、葛根发酵液样品处理24 h的细胞裂解液(蛋白浓度已测定),添加过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40 μL,混匀。再加入10 μL 250 mmol/L H2O2溶液,用移液器迅速混匀。反应 3 min后,加入450 μL过氧化氢酶反应终止液,对照标准曲线计算残余H2O2浓度。换一洁净离心管,加入40 μL过氧化氢酶检测缓冲液,再加入10 μL已终止并混匀的上述反应体系,混匀。25 ℃孵育15 min后,测定520 nm波长处吸光度A,计算过氧化氢酶活力。

消耗过氧化氢(μmol/L)=空白对照残余过氧化氢-样品残余过氧化氢

过氧化氢酶活力(U/mg蛋白)=[消耗过氧化氢×稀释倍数]/[(反应时间)×(样品体积)×(蛋白浓度)]

1.2.7 人皮肤成纤维谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力的测定 按照谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒说明书进行样品测定。依次配制10 mmol/L NADPH溶液、84 mmol/L GSH溶液、GPx检测工作液、过氧化物试剂溶液,均温育到25 ℃。设定空白对照组(GPx检测缓冲液186 μL+GPx检测工作液10 μL+过氧化物试剂溶液4 μL)、样品本底对照组(Gpx检测缓冲液180 μL+GPx检测工作液10 μL+待测样品10 μL)、样品组(GPx检测缓冲液176 μL+GPx检测工作液10 μL+待测样品10 μL+过氧化物试剂溶液4 μL)。依次加入检测缓冲液、待测样品和检测工作液,混匀,加入过氧化物试剂溶液4 μL,反应开始。保持测定温度为25 ℃,每隔30 s,使用酶标仪测定A340,共测6次。根据谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义测定GPx活力。

检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力=(A340/样品反应时间-A340/空白反应时间)/0.00622

谷胱甘肽过氧化物酶活力(mU/mg蛋白)=检测体系重谷胱甘肽过氧化物酶活力×稀释倍数/样品中蛋白浓度(U/mg)

1.2.8 人皮肤成纤维细胞I型胶原(Collagen I)含量的测定 按照人I型胶原酶联免疫检测试剂盒说明书进行样品测定。葛根水提液、葛根发酵液样品溶液在3个质量浓度(0.06、0.53、5.00 mg/mL)条件下处理人皮肤成纤维细胞24 h后,取细胞培养液上清液,于2～8 ℃、1000×g离心15 min,取上清液立即进行测定。在预先包被了抗体的酶标孔中加入样品或标准品,在加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的识别抗原,在37 ℃条件下孵育1 h,两者与固相抗原竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤后,结合的HRP催化四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450 nm波长处测定吸光度。同时,测定出胶原标准品的OD值,并以OD值为纵坐标,胶原浓度为横坐标,用Curve Expert1.4拟合出胶原含量的标准曲线 y=a/(1+be-cx)(a=-2.546,b=-2.518,c=-3.478),并由所测细胞培养上清液的OD值计算出样品中所含胶原含量。

1.2.9 人皮肤成纤维细胞MMP-1含量的测定 按照MMP-1酶联免疫检测试剂盒说明书进行样品测定。葛根水提液、葛根发酵液在5个质量浓度条件下(0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL)处理人皮肤成纤维细胞24 h后,取细胞培养液上清液,于2～8 ℃、1000×g离心15 min,取上清液立即进行测定。在包被有纯化MMP-1抗体的微孔板中,依次加入样品或标准品、生物素化的抗MMP-1抗体、HRP标记的亲和素,经彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的作用下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅与样品中MMP-1含量呈正相关。用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度,对照标准曲线来计算样品刺激后MMP-1含量,标准曲线为y=a/(1+be-cx)(a=1.111,b=2.436,c=1.134)。

1.3 数据处理

本实验均设置3组平行,实验数据利用SPSS 19.0软件进行统计学处理,两两比较采用t检验,以p<0.05为差异有统计学意义,所得结果以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 葛根水提液(PWE)、葛根发酵液(PFB)中活性成分测定结果

表1为葛根水提液及葛根发酵液中黄酮、总糖含量测定结果。表1显示,葛根水提物、葛根发酵液中均含有丰富的黄酮、糖类。其中,葛根水提液中,黄酮得率为5.25%,含量为(3.47±0.23) mg/mL,总糖的得率为5.19%,含量为(3.46±0.18) mg/mL。葛根发酵液中,黄酮得率为7.20%,含量为(4.80±0.32) mg/mL,总糖的得率为3.78%,含量为(2.52±0.50) mg/mL。说明与葛根水提液相比,葛根发酵液中的黄酮含量较高,其总糖含量相对较低。

表1 葛根水提液及葛根发酵液中黄酮、总糖含量Table 1 Content of flavonoids,total sugar in PWE,PFB

2.2 PWE、PFB对DPPH自由基的清除作用

葛根的水提液和葛根发酵液对DPPH自由基的清除作用见图1。从图1可知,在质量浓度为2.67～4.44 mg/mL,相同质量浓度下葛根发酵液对DPPH自由基的清除率高于葛根水提液。在质量浓度在4.44～13.3 mg/mL间,两者差异并不显著。通过数据计算得出,葛根水提液清除DPPH自由基的IC50为3.51 mg/mL。葛根发酵液清除DPPH自由基的IC50为2.98 mg/mL。说明葛根发酵液在较低浓度即可清除50%的DPPH自由基,葛根水提液所需浓度较高。

图1 葛根水提液、葛根发酵液清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of PWE and PFB

2.3 PWE、PFB对人皮肤成纤维细胞活力的影响

通过MTT实验探究不同浓度的葛根提取液对成纤维细胞的细胞活力的影响,结果见图2～图3。由图可知,葛根水提液及葛根发酵液均未表现出强烈的细胞毒性,细胞活力均在85%以上。相同质量浓度下,样品的作用时间对细胞活力无显著影响,因此本实验选用样品作用时间为24 h进行后续实验。本实验选择了三个浓度,分别为5 mg/mL(高剂量组)、0.53 mg/mL(中剂量组)、0.06 mg/mL(低剂量组)进行后续实验。

图2 不同质量浓度的葛根水提液对细胞活力的影响Fig.2 Effect of different concentrations of PWE on cell viability of human skin fibroblasts

图3 不同质量浓度的葛根发酵液对细胞活力的影响Fig.3 Effect of different concentrations of PFB on cell viability of human skin fibroblasts

2.4 PWB、PFB对人皮肤成纤维细胞过氧化氢酶的影响

图4为葛根水提液、葛根发酵液对细胞中过氧化氢酶活力的影响。由图4可知,在质量浓度为0.53、5 mg/mL时,经葛根水提液及葛根发酵液处理后的细胞可以极显著增强细胞内过氧化氢酶的酶活力(p<0.01)。质量浓度为0.06 mg/mL时,作用不显著(p>0.05)。相同质量浓度的两种样品对细胞中过氧化氢酶活力影响不显著(p>0.05)。由此说明葛根水提液及发酵液能够增强细胞内过氧化氢酶酶活力,氧化氢酶是机体内反应细胞氧化水平的重要标志性酶之一,其主要作用是催化体内的过氧化氢分解成氧气和水,从而避免过量的H2O2与O2在铁螯合物的作用下生成对细胞有害的羟基[35]。宋菲等人[36]经过研究证实,天然椰子油提取物可通过提高细胞内抗氧化酶的活性,进而对 H2O2引起的细胞氧化应激损伤起到一定的保护作用。衰老自由基学说认为,机体自由基累积引发的氧化应激损伤在皮肤衰老中发挥重要作用,氧化应激指机体内活性氧产生和清除失衡、抗氧化能力降低,自由基产生增多一种状态,过度的氧化应激产生的过氧化物会破坏DNA和蛋白质结构,导致生物膜和细胞核的损伤,引发细胞凋亡,是衰老的主要成因之一[37]。由此说明,葛根水提液及发酵液能够通过增强细胞内过氧化氢酶活力,从而加快细胞内过氧化物的分解,达到抗衰老的功效。

图4 葛根水提液、葛根发酵液对细胞中过氧化氢酶活力的影响Fig.4 Effect on PWE and PFB on catalase activity注:*代表样品组与细胞对照组差异显著(p<0.05);**代表样品组与细胞对照组差异极显著(p<0.01);图5～图6同。

2.5 PWE、PFB对人皮肤成纤维细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力影响

由图5可知,在质量浓度为0.06、0.53 mg/mL时,葛根水提液可以极显著增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力(p<0.01),葛根发酵液处理后的细胞可以显著增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力(p<0.05),质量浓度为5.00 mg/mL时,作用不显著(p>0.05)。不同样品下相同质量浓度的样品对细胞中细胞谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的影响差异不显著(p>0.05),葛根水提液及发酵液均在质量浓度为0.53 mg/mL时,增加谷胱甘肽过氧化物酶酶活力作用更为显著。由此说明,葛根水提液及发酵液能够增强细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力,谷胱甘肽过氧化物酶[38]是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶,特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。冯冰等人[39]实验证明,过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤后,EGCG能够有效降低细胞内谷胱甘肽过氧化物酶降低,同时EGCG可将其作为植物提取物防护细胞损伤研究的阳性对照。由此说明,葛根水提液、葛根发酵液能够通过增加细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力,从而增强细胞内清除过氧化物的能力,达到抗衰老的效果。

图5 葛根水提液、葛根发酵液对细胞中谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响Fig.5 Effect on PWE and PFB on GSH-Px activity

2.6 PWE、PFB对细胞中MMP-1含量、Ⅰ型胶原含量的影响

由图6A可知,葛根水提液质量浓度为0.06、5 mg/mL，可以显著降低人皮肤成纤维细胞中MMP-1含量(p<0.05),葛根发酵液作用下的MMP-1减少率较葛根水提液更高,作用极为显著(p<0.01)，葛根水提液质量浓度为0.53 mg/mL时,作用不显著。由图6B可知,在质量浓度为0.06、5 mg/mL时,葛根水提液可以显著增加人皮肤成纤维细胞中Ⅰ型胶原的含量(p<0.05),当质量浓度为0.53 mg/mL时,作用不显著(p>0.05)。另外，葛根发酵液作用下的细胞Ⅰ型胶原的增加率较葛根水提液更高,作用极为显著(p<0.01)。浓度为0.06 mg/mL的葛根发酵液与葛根水提液增加量最多,分别为(26.67±2.10) ng/mL、(21.47±1.66) ng/mL,分别是细胞对照组的2.5倍、2倍(细胞对照组为(10.79±0.98) ng/mL)。生化实验中,葛根发酵液相比于葛根水提液,清除DPPH自由基的作用更为显著。而在细胞实验中,葛根发酵液比葛根水提液均能够增加细胞内胶原蛋白的含量。此差异很有可能是因体外抗氧化实验机理与细胞实验中细胞内过氧化物及相关物质的产生机理不同,所以结果上有差异。

图6 葛根水提液、葛根发酵液对人皮肤成纤维细胞MMP-1(A)和I型胶原蛋白含量(B)的影响Fig.6 Effect of PWE,PFB on MMP-1(A) and COL I(B)contents

3 结论

本研究的结果表明,葛根发酵液中的黄酮含量高于葛根水提液,葛根水提液的总糖在一定程度上高于葛根发酵液。葛根发酵液能有效清除DPPH自由基,且清除率基本保持在50%及以上,作用较为明显,可初步表明葛根发酵液具有一定的抗氧化活性。体外细胞实验结果表明,不同浓度的葛根水提液及葛根发酵液能够不同程度上保持较高的细胞活力,均为表现出强烈的细胞毒性,细胞活力均在85%以上;此外,与对照组相比,葛根水提液及葛根发酵液处理后的细胞可以极显著增强细胞内过氧化氢酶酶活力(p<0.01)、谷胱甘肽酶酶活力(p<0.01),不同样品下相同质量浓度的样品差异明显,由此说明葛根水提液及发酵液均能够在一定程度上减少过氧化物对细胞的损伤,达到抗衰老的效果。与对照组相比,在质量浓度为0.06、5 mg/mL时,葛根水提液及葛根发酵液处理后的细胞可以显著减少MMP-1的含量(p<0.05),增加细胞中Ⅰ型胶原的含量(p<0.05),不同样品下相同质量浓度的样品差异明显。葛根发酵液相较于葛根水提液,抗氧化及抗衰老作用更为明显。综上所述,葛根水提液及葛根发酵液均具有不同程度的抗氧化功效和抗衰老功效。