意大利蜜蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶(PTS)的生物信息学分析

舒蕊 刘健 章玉萍 张丽丽 陈明 代君君 范涛

（安徽省农业科学院蚕桑研究所，合肥 230031）

蜜蜂是昆虫膜翅目家族中的重要成员，不仅是重要的农业经济昆虫，也是科学研究中的模式生物。我国饲养的西方蜜蜂品种中，黄色蜂种占有较大比重，特别是以意大利蜜蜂为主的黄色蜂种。意蜂群中的个体表现出不同程度黄体色：雄蜂为黄色到暗棕色，绒毛淡黄色尤为明显；工蜂的腹部具两个黄色环带的个体居多，绒毛淡黄色；蜂王的腹部多为黄色到暗棕色，尾部黑色，只有少数蜂王通体都是黄色。黄色蜂种及其杂交种遍布全国各地，在养蜂生产中发挥着重要作用[1]。然而，意蜂黄体色的形成机制一直未解。众所周知，昆虫黄色色素的形成源自蝶呤类色素，四氢生物蝶呤（BH4）合成途径与蝶呤类色素的合成与代谢息息相关。BH4是芳香族氨基酸羟化酶的必需辅酶，也是一氧化氮合酶（NOS）的重要辅助因子，还能作为NOS的调控因子或直接作为自由基清除剂参与氧化应激作用[2,3]。BH4的合成不足会导致神经递质的缺乏以及细胞内皮功能障碍，引发多种神经性生理代谢疾病，临床医学上把口服BH4作为治疗其中某些疾病的有效方法[4-6]。现阶段，BH4合成代谢网络在双翅目模式生物黑腹果蝇和鳞翅目模式生物家蚕中都有较多的研究，但是在以蜜蜂为代表的膜翅目昆虫中几乎没有研究报道。研究蜜蜂体内BH4合成途径对于意蜂乃至膜翅目的色素合成与代谢至关重要。

6-丙酮酰四氢蝶呤合酶（6-pyruvoyl tetrahydrobiopterin synthase，PTS）是BH4合成代谢途径中的关键酶。PTS催化BH4从头合成途径中的第二步反应，即催化二氢新蝶呤三磷酸转变为6-丙酮酰四氢蝶呤（PTP），该反应依赖于Mg2+和Zn2+[7-9]。人类和哺乳动物的PTS基因结构是高度保守的，它们的基因组序列有6～7kbp，包含6个外显子。研究表明，PTS酶的功能异常导致BH4合成受阻，从而引起人类罹患BH4缺乏症。此类患者体内分离发现了大量的PTS基因突变的位点，其中44个突变位点分布在PTS基因所有的6个外显子和前面3个内含子的区域内。除了大量的突变位点，不同物种的PTS基因表达与调控方式也有不同。比如，果蝇的PTS基因转录了两种类型的PTS mRNA：一类是受近端启动子作用的，只在头部特异出现，具有3个外显子的序列；另一类是受远端启动子作用的，在5’端非翻译区多了一段新的内含子序列。但是这两类mRNA在果蝇体内表达的ORF序列是一样的[10]。

生物信息学方法在功能基因的测序、识别、功能预测、结构分析等方面都发挥着重要作用。自意蜂基因组全序列测序完成后，越来越多的生物信息学方法应用到意蜂各类基因的研究工作中。生物信息学分析将促进人们对于意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的了解和认识。

本文选择意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶，采用生物信息学方法，对其相应氨基酸序列的理化性质、疏水性、跨膜区、结构功能域以及空间二级结构和三级结构等方面进行分析和预测，并构建系统进化树，旨在为日后深入研究意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶家族的结构和功能解析及应用等方面提供有力帮助和理论依据。

1 材料与方法

1.1 序列来源

来自NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的意大利蜜蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶（序列号XM-623992）。

1.2 方法

使用ProtScale分析蛋白质疏水性，使用ORFFinder和ProtParam对编码意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的氨基酸组分和理化性质进行分析，使用网站TMHMM预测蛋白质跨膜区，结构功能域分析使用SMART服务器，蛋白质二级结构预测使用PORTER完成，蛋白质三级建模使用SWISS-MODEL完成，使用软件MEGA 6.0构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

使用ORF Finder和ProtParam分析意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的蛋白组分和理化性质(表1)。意蜂PTS基因全长829bp，含有一个429bp的开放阅读框，编码142个氨基酸，氨基酸组成中，不含Pyl和Sec，Lys含量最高，达到11.3%。含有20个酸性氨基酸（Asp+Glu），20个碱性氨基酸（Arg+Lys），氨基酸序列的不稳定系数为33.06，说明此蛋白是稳定的。预测蛋白分子量为16.66027kDa，理论等电点（pI）为6.96，原子组成为C745H1179N195O219S9，脂肪族氨基酸指数为89.08，亲水性指数为-0.499，表明其为亲水性蛋白。

2.2 疏水性分析

图1 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶氨基酸序列的疏水性分析

ExPASy的ProtScale是常用的预测蛋白质疏水性的分析方法。使用ProtScale工具在线分析意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的疏水性（图1），其计算方法是基于K-D法的蛋白质疏水性。6-丙酮酰四氢蝶呤合酶氨基酸序列中负值的亲水性氨基酸的比例高于正值的疏水性氨基酸，因而判断其为亲水性蛋白，与理化性质分析结果一致。

表1 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因蛋白组分和理化性质

2.3 跨膜区分析

使用TMHMM工具对意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶进行跨膜区分析（图2）。基于TMHMM计算的后验概率，6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的142个氨基酸都在膜外，该酶是一个典型的膜外蛋白，不是跨膜蛋白质。

图2 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶氨基酸序列的跨膜区分析

2.4 结构功能域分析

分析结构功能域对于蛋白质结构的分类和预测非常重要，使用SMART服务器进行意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的结构功能域分析（图3）。意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶在序列的7～140位点含有一个6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶结构域。

图3 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶结构功能域分析

2.5 二级结构预测

蛋白质的二级结构预测既是联系一级结构和三级结构的纽带，也为后续蛋白质三级结构的预测提供信息。使用PORTER服务器预测意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶蛋白质的二级结构（图4）。意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶主要由4种二级结构组成，预测结果显示58个氨基酸为α-螺旋，占比40.85%，其次是无规卷曲共41个氨基酸，占比28.87%，35个氨基酸是β-折叠，共占24.65%，β-转角有8个氨基酸，占5.63%。

图4 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶二级结构预测

2.6 三级结构预测

图5 意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶三级结构模拟

蛋白质的生物学功能在很大程度上是由其空间结构决定的，将蛋白质的高级结构分析清楚是理解其功能的关键。通过SWISS-MODEL同源建模意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶蛋白的三级结构，一般相似性超过50%即可获得较精确的结构模型（ID：3i2b.1.A，序列一致性56.52%），同源建模如图5。

2.7 系统进化树分析

系统进化树发育分析是生物信息学中的重要研究领域，通过它的计算分析可以判断物种之间的亲缘关系。本研究先在NCBI网站中搜索PTS序列信息，然后分别选择膜翅目、双翅目、鳞翅目、鞘翅目共15种昆虫的PTS蛋白序列，构建系统进化树（图6）。分析结果表明，意大利蜜蜂与小蜜蜂、大蜜蜂以及中华蜜蜂的进化关系最密切。该结果为后续开展意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶家族功能基因的实验研究提供了参考信息。

图6 15种昆虫6-丙酮酰四氢蝶呤合酶的系统进化树

3 讨论

蜜蜂在生物学上是全变态昆虫，在农业上是重要的授粉昆虫，在科研中亦是重要的模式生物。目前对昆虫6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因的研究多集中在果蝇和家蚕等其他种类的昆虫上，而膜翅目意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因的研究却鲜有报道。意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因在蛋白质结构和生物学功能方面相对于其他昆虫是否有特别之处，需要科学工作者们做更多的研究与探索。本研究利用生物信息学方法对意大利蜜蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因进行了系统分析，结果表明，意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合酶基因全长829bp，含有一个429bp的开放阅读框，编码142个氨基酸，属于亲水性蛋白；预测蛋白分子量为16.66027kD，理论等电点（pI）为6.96，原子组成为C745H1179N195O219S9；二级结构主要由α-螺旋构成；在序列的7～140位点含有一个6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶结构域，含有相应的催化结构域和底物结合域；蛋白的二级结构主要由α-螺旋组成，其次是无规卷曲和β-折叠，同源建模了蛋白质的三级结构；使用15种6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶氨基酸序列构建系统进化树，分析结果与传统的生物学分类结果一致。

本文的研究结果为深入开展意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶的科学研究提供参考信息，为意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶基因家族的分离、纯化及克隆分析提供参考，也为进一步研究其高级结构与功能关系提供理论依据。本文是基于生物信息学工具对目标基因进行的系统研究，关于意蜂6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶的具体生物学功能和表达机制等还需进一步研究。