中草药对肠源性大肠杆菌的体外抑菌试验研究

易 力，刘 璐，杨伟平，张海艳

（洛阳师范学院生命科学学院，河南 洛阳 471934）

大肠杆菌又称为大肠埃希氏菌，主要寄居在人和动物的肠道内，属于正常菌群，仅具有特殊血清型的菌株存在致病性[1]。大肠杆菌病为人畜共患病，致病菌侵入人体和动物体后，除引起腹泻、肠炎，也可能会引起急性败血症，腹膜、胆囊等部位产生炎症[2-3]。

随着养殖业的不断发展，人们常使用大量的抗生素来防治大肠杆菌病，抗生素滥用情况日趋加剧，目前已发现猪、鸡、鸭等动物源大肠杆菌对抗生素具有很强的耐药性，给畜禽业的持续稳定发展带来了隐患，使养殖成本和养殖风险提高[4-6]。在抑制肠源性大肠杆菌方面，中药因具有抑菌效果好、毒性小、残留少、不易引发菌株产生抗药性，抗耐药机制神秘突变，同时避免了抗生素对益生菌的杀灭等优点，使得人们对其进行深入研究，并逐步应用于生产实践中[7-8]。

鉴于前人对中药抑制肠源性大肠杆菌的研究不多，尤其是对鱼源性和鹅源性大肠杆菌的抑制研究少之又少，所以本试验通过测定10 味中草药对鸡、鱼、鹅3 种肠源性大肠杆菌的抑菌效果，来筛选出对肠源性大肠杆菌具有抑菌作用的有效中草药，为预防和治疗肠源性大肠杆菌病提供理论依据[9]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 中草药

石榴皮、白术、黄芩、连翘、乌梅、黄连、柴胡、野菊花、金银花、蒲公英10 味中草药购于洛阳市一杆称大药房。

1.1.2 试验菌株

从鸡粪、鱼粪、鹅粪中分别分离肠源性大肠杆菌，备用[10]。

1.1.3 培养基EMB 固体培养基、LB 液、固体培养基，按常规方法配置，121 ℃高压灭菌20 min。

1.1.4 主要设备

96 孔微量反应板、电子天平、立式高压蒸汽灭菌锅、振荡培养箱、恒温培养箱、超净工作台、常温高速离心机、Synergy H1酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离与保存

采集新鲜鱼粪、鸡粪和鹅粪，用0.85%无菌生理盐水按照10倍梯度稀释到10-9备用，选择合适的稀释度的稀释液0.1 mL，涂布到EMB 平板，37 ℃恒温培养24 h，观察EMB 平板上呈深紫色有金属光泽的单个典型菌落即为大肠杆菌初步分离株，将其接种于LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h，将肠源性大肠杆菌保存于50%甘油:菌液=1:1的无菌甘油中，-20 ℃保存备用，最终保存鸡源性大肠杆菌、鱼源性大肠杆菌、鹅源性大肠杆菌各50株。

1.2.2 单味中草药液制备

用电子天平称取10 味中药各25 g，10 味中草药采取不同的制备方法。5 味中草药（蒲公英、柴胡、黄芩、黄连、乌梅），分别放入添加200 mL蒸馏水的烧杯中浸泡1 h，使用电炉快速加热至煮沸，改小火煎煮30 min，用4层纱布过滤药液，药渣加水100 mL煮沸后煎煮30 min，再次用4层纱布过滤药液，合并两次滤液，使用电炉小火浓缩至12.5 mL（即含药量为2 g·mL-1），药液分装完做好标记[11]。金银花、连翘、乌梅、白术、野菊花根据参考文献制备[12-15]。最后，将上述制备好的10味中草药液于121 ℃高压灭菌20 min，放入冰箱4 ℃保藏备用。

1.2.3 体外抑菌实验

药敏片的制备：选用直径为6 mm 的打孔器，制备直径为6 mm的滤纸片，121 ℃高压灭菌20 min后，烘箱干燥，然后将滤纸片置于中草药液中浸泡24 h，将滤纸片取出于60 ℃烘箱烘干，制成药敏片，置于无菌条件下保存备用[16]。

菌悬液的制备：从3种肠源性大肠杆菌的50株菌株中各随机选取某一株进行活化，将菌株接种于LB 液体培养基，37 ℃恒温振荡培养箱培养至对数生长期，用酶标仪测定菌液OD600值，采用平板菌落计数法测定菌液浓度，建立OD600值与菌液浓度对应关系，用无菌生理盐水稀释菌液，使浓度为108cfu·mL-1，作为试验的目标菌悬液[14]。

K-B法抑菌实验：在超净工作台用移液枪吸取浓度为108cfu·mL-1的目标菌悬液100 μL于配制好的固体LB 培养基平板，用涂布棒均匀涂布，用无菌镊子取出药敏片贴在含菌平板上，每个平皿放3个，每种药敏片做3组对照。将培养皿置于37 ℃恒温培养箱培养12 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径[17]。对抑菌效果较好的中草药液进行MIC值测定。

最小抑菌浓度MIC 的测定：使用二倍稀释法，取100 μL 中草药液，加入到灭菌的96 孔聚苯乙烯板第1竖列第1孔中，在第1竖列第2孔到第8孔均加入50 μL液体LB培养基，从第1孔吸50 μL药液加入第2孔混匀，从第2孔吸50 μL药液加入第3孔混匀，如此连续稀释至第8 孔，并从第8 孔吸取50 μL 弃去，稀释完成后，每孔加入50 μL 菌悬液浓度为108cfu·mL-1，使用盖板，37 ℃恒温培养12 h，测OD600值，以完全抑制大肠杆菌生长的最低中草药液浓度为MIC值[18]。

最小杀菌浓度MBC 的测定：将上述96 孔聚苯乙烯板的液体取50 μL 涂布于固体LB 培养基平板，37 ℃恒温培养24 h 后观察，以无菌落生长的最小药液浓度为MBC[19]。

2 试验结果

2.1 不同中草药液对肠源性大肠杆菌的抑制作用

选取石榴皮、白术、黄芩、连翘、乌梅、黄连、柴胡、野菊花、金银花、蒲公英10 味中草药，通过K-B 法对肠源性大肠杆菌进行体外抑菌试验。抑菌结果的判定：抑菌圈直径＜7.5 mm为耐药；在7.5～10 mm 为轻度敏感；在10～14 mm 为中度敏感；在15～20 mm为高度敏感；＞20 mm为极度敏感[20]。

对鸡源性大肠杆菌存在抑菌作用的5味中草药的抑菌作用见表1。

表1 对鸡源性大肠杆菌存在抑菌作用的5味中草药的抑菌作用

由表1可知，当药液浓度为2.0 g·mL-1时，有5味中草药（石榴皮、白术、黄芩、连翘、野菊花）对鸡源性大肠杆菌具有抑菌作用且表现出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直径以石榴皮的抑菌作用最强，为中敏。其他5 味中草药（黄连、柴胡、乌梅、金银花、蒲公英）未表现出抑菌作用。由试验结果可知，有5 味中草药对鸡源性大肠杆菌存在抑菌作用，且抑制作用强弱顺序为：石榴皮＞连翘＞黄芩＞野菊花＞白术。

对鱼源性大肠杆菌存在抑菌作用的4 味中草药抑制效果见表2。

由表2可知，当药液浓度为2.0 g·mL-1时，有4味中草药（石榴皮、白术、黄芩、柴胡）对鱼源性大肠杆菌具有抑菌作用且表现出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直径以石榴皮、黄芩的抑菌作用较强，为中敏。其他6 味中草药（连翘、乌梅、黄连、野菊花、金银花、蒲公英）未表现出抑菌作用。由试验结果可知，有4味中草药对鱼源性大肠杆菌存在抑菌效果，且抑制作用强弱顺序为：石榴皮＞黄芩＞白术＞柴胡。

表2 对鱼源性大肠杆菌存在抑菌作用的4味中草药的的抑制效果

对鹅源性大肠杆菌存在抑制作用的4味中草药抑菌效果见表3。

由表3可知，当药液浓度为2.0 g·mL-1时，有4味中草药（石榴皮、白术、连翘、乌梅）对鸭源性大肠杆菌具有抑菌作用且表现出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直径以石榴皮的抑菌作用最强，为中敏。其他6 味中草药（黄芩、柴胡、黄连、野菊花、金银花、蒲公英）未表现出抑菌作用。由试验结果可知，有4味中草药对鸭源性大肠杆菌存在抑菌作用，且抑制作用强弱顺序为：石榴皮＞连翘＞乌梅＞白术。

表3 对鹅源性大肠杆菌存在抑制作用的4味中草药的抑菌效果

2.2 中草药液最小抑菌浓度（MIC）的测定结果

根据2.1试验结果选择石榴皮、黄芩两味中药，通过二倍稀释法测定其对肠源性大肠杆菌的MIC值。MIC 测定结果判断标准，MIC＜7.82 mg·mL-1时，表现为高度敏感，7.82～250 mg·mL-1，表现为中度敏感，MIC＞250 mg·mL-1，表现为不敏感[21]。石榴皮药液对肠源性大肠杆菌的MIC的测定、黄芩药液对鱼源性大肠杆菌的MIC的测定见表4、5。

表4 石榴皮药液对肠源性大肠杆菌的MIC的测定

表5 黄芩药液对鱼源性大肠杆菌的MIC的测定

由表4可知，中草药液石榴皮对鸡源性、鱼源性、鹅源性大肠杆菌的MIC均为0.5 g·mL-1。由表5可知，中草药液黄芩对鱼源性大肠杆菌的MIC值为1.0 g·mL-1。两味中药的MIC均为不敏感。

3 讨 论

为研究中草药对肠源性大肠杆菌的抑制作用，本试验在参考大量文献的基础上，选择了具有清热解毒、泻下、补虚功效的中药，有野菊花、连翘、蒲公英、金银花等，采用水煎煮法制成中草药液，进行体外抑菌实验，结果表明，黄芩对鱼源性大肠杆菌存在较强抑制作用，石榴皮对3种肠源性大肠杆菌均存在较强的抑制作用[22]。而黄连、连翘等中药的抑菌作用不明显或者不存在抑菌作用[23]。可能与以下因素有关：采用水煎煮法制备药液，温度、时间等因素控制不严格，使中草药的成分造成破坏，抑菌作用减弱[24]；不同的提取剂也会对中药功效造成影响，如本试验采用水提法提取的乌梅药液，对肠源性大肠杆菌不存在抑制作用，而南平遥采用无水乙醇提取的乌梅药液，对大肠杆菌表现出极度敏感的抑制作用[25]；不同炮制方法会影响中药的功效，如刘腾飞等对黄连的研究表明，生黄连的抑菌作用强于酒制黄连，黄连超微粉水浸液的抑菌作用强于黄连水煎液[26]；同种中药对不同菌种存在的抑菌作用不同，这也是黄芩只对鱼源性大肠杆菌存在较强的抑制作用的原因；该试验选用的菌种是从分离得到的菌种中随机选择的，试验菌种是否具有耐药性，致病性等并无研究。下一步将对菌种进行一系列的生理生化指标鉴定，采用多种方法制备中草药液，探究抑菌效果的不同。

根据试验结果可知，石榴皮、黄芩的抑菌作用较强，这可能与其有效成分有关，舒扬雄等研究表明，中草药石榴皮的主要抗菌成分是单宁类物质[27]。吴蕊等研究表明，中草药黄芩的主要抗菌成分是黄芩苷和黄芩素[28]。因此如何将中草药中的有效成分提取出来，是研究中草药作用机理的下一步。

本试验对鸡源性、鱼源性、鹅源性大肠杆菌病的预防和治疗具有指导作用。因中药成分复杂，有效成分之间的相互关系不确定，以及复杂的综合治疗机制，因此要想确定某味中药准确的抑菌效果，为禽类疾病的预防和治疗提供可靠的依据，必须结合体内抑菌实验，共同探索中药的抑菌机理[29]。